氨基糖苷類抗生素與抗菌劑不同毒性比混合對大腸桿菌的聯合效應研究

楊越, 孫昊宇, 龍茜, 張躍恒, 林志芬, 印春生,*

1. 上海海洋大學海洋生態與環境學院,上海 201306

2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室,同濟大學環境科學與工程學院,上海 200092

抗菌劑是一類通過抑制病源微生物生長或代謝來治療感染性疾病的化合物總稱[1]。 由于抗菌劑具有廣譜抗菌性和應用安全性等特點,被廣泛應用于醫療業、農業以及畜牧業等行業[2]。 然而,抗菌劑的長期濫用導致細菌耐藥性問題不斷加劇,使抗菌劑的抑菌效果不斷降低[3],可能對人類健康以及生態系統造成嚴重影響。 面對細菌耐藥性的威脅,有研究人員認為將不同抗菌劑聯合使用或許是控制細菌耐藥性污染的重要途徑之一[4]。 抗菌劑的聯合使用會導致抗菌劑可能以混合污染物的形式進入生態環境中,它們之間的相互作用可能會對環境中的生物造成有別于單一抗菌劑的毒性威脅。 因此,有必要探索抗菌劑的聯合毒性效應,這可以為今后抗菌劑聯用誘導的環境暴露風險評估提供參考。

氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides, AGs)是一類由單組分或多組分糖基取代的氨基環醇類化合物,具有高效、廣譜的抗菌活性,已經成為治療革蘭氏陰性病原體感染的重要選擇之一[5]。 隨著全球抗生素耐藥性問題不斷惡化,AGs 在臨床實踐中已變得越來越重要[6]。 基于其臨床使用的不可替代性[7],AGs 與其他抗菌劑的聯合使用成為了抗感染研究領域的熱點之一[4]。 其中,可以與AGs 聯合使用的其他抗菌劑包括傳統抗菌劑和新型抗菌劑。 常見的傳統抗菌劑可以分為磺胺類、四環素類、大環內酯類、糖肽類和β-內酰胺類等[8],它們在農業、畜牧業和醫療業等多個領域被廣泛用于治療多種細菌感染。 新型抗菌劑則包括唑啉類、表面活性劑類和群體感應抑制劑類等類別,它們因不易產生耐藥性等特點被逐漸應用于化工和食品行業,表現出較好的殺菌性能。 這些聯合使用的抗菌劑主要通過醫用和農用這2個途徑進入生態環境中,對微生物、水生生物和人類造成潛在危害[9];同時,多種抗菌劑暴露在環境中會產生區別于單一抗菌劑的毒性效應。 那么AGs 與這些抗菌劑混合暴露在環境中又會存在怎樣的環境風險?

目前有許多研究報道了AGs 與其他抗菌劑的聯合效應,如 Giamarellou 等[10]研究發現 AGs 和β-內酰胺類藥物對銅綠假單胞菌的聯合效應表現為協同。 此外,崔潔和李志光[11]在探究甲氧芐啶與AGs對大腸桿菌的聯合毒性時發現其混合暴露表現出相加的聯合效應。 這些研究結果表明AGs 與抗菌劑的聯合毒性效應可能與抗菌劑種類密切相關。 此外,抗菌劑以不同毒性比(毒性比是指單一抗菌劑半數最大效應濃度(EC50)的比例[12])混合也可能會導致不同的聯合毒性效應,并引起不同的環境風險。 如Tian 等[13]研究氰基物質和醛類對發光菌的聯合效應時發現,隨著毒性比從等毒性比變為非等毒性比,混合物聯合作用由協同作用變為相加作用。 Liu等[14]研究了阿莫西林和螺旋霉素對銅綠微囊藻的聯合效應時發現,毒性比從等毒性比變為非等毒性比,混合物聯合作用從協同作用變為了拮抗作用。 因此,有必要研究AGs 與其他不同種類抗菌劑在不同毒性比下的聯合效應,為評估AGs 和其他抗菌劑不同比例混合暴露的環境風險提供依據。

大腸桿菌(Escherichia coli)具有容易獲取、操作簡便以及應用安全等特點,被廣泛應用于細菌生理學、病毒和遺傳學研究。 因此本文選擇大腸桿菌作為模式生物,以磺胺類、四環素類、大環內酯類、糖肽類和β-內酰胺類抗菌劑作為傳統抗菌劑的代表,以唑啉類、表面活性劑類和群體感應抑制劑類作為新型抗菌劑的代表,將這些抗菌劑與AGs 進行聯合毒性實驗,測定AGs 與多種抗菌劑在不同比例情況下(以1 ∶1、1∶5、5∶1 這 3 種毒性比為代表)的聯合毒性效應,并對它們的聯合毒性機制進行初步探討,旨在為研究AGs與不同抗菌劑混合暴露的環境風險評估提供支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與生物

測試化合物中6 種AGs(硫酸慶大霉素、硫酸鏈霉素、硫酸新霉素、妥布霉素、硫酸卡那霉素和異帕米星)、大環內酯類(紅霉素)、糖肽類抗菌劑(鹽酸萬古霉素)、β-內酰胺類抗菌劑(氨芐青霉素)、唑啉類抗菌劑(甲基異噻唑啉酮)以及表面活性劑類抗菌劑(十二烷基三甲基溴化銨),均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(中國)。 磺胺類抗菌劑(磺胺甲惡唑)、四環素類抗菌劑(鹽酸金霉素)以及群體感應抑制劑類抗菌劑(3,4-溴2(5H)呋喃酮)均購自Sigma-Aldrich化學制品有限公司(美國)。 測試抗菌劑純度均為分析純以上,其基本信息如表1 所示。 本實驗中使用的模式生物為大腸桿菌K-12 MG1655 (Escherichia coli,E.coli),購自Biovector 生物科技有限公司(中國)。

1.2 毒性試驗

1.2.1 單一毒性的測定方法

式中:OD600,0為E.coli在無染毒作用下對照組在600 nm 處的OD 平均值,OD600,i為測試抗菌劑作用下實驗組在600 nm 處的OD 平均值。 單一抗菌劑對E. coli抑制率的劑量-效應關系使用Origin 軟件(版本2021,OriginLab,美國)進行擬合,計算出抑制率為50%時對應的抗菌劑濃度,即為單一抗菌劑的EC50(mg·L-1)。

1.2.2 聯合毒性的測定方法

根據單一化合物的EC50,配制抗菌劑A 與抗菌劑 B 在 1∶1、1∶5 和 5∶1 毒性比的混合溶液,按照單一毒性測定方法測定系列混合溶液的聯合毒性,計算出EC50mix(mg·L-1)。 然后,采用毒性單位(toxicity unit,TU)法來表征聯合毒性效應,TU 值的計算如下式:

式中:CA、CB是混合體系產生50%抑制效應時抗菌劑A、B 各自的濃度,EC50A和EC50B是單一抗菌劑A、B 分別作用產生50%抑制效應時的濃度。 根據Broderius 的聯合毒性作用判別標準[15],當TU＜0.8 認為2 組分間為協同作用;0.8≤TU≤1.2 認為2 組分間為相加作用;TU＞1.2 認為2 組分間為拮抗作用。

2 結果和討論(Results and discussion)

2.1 AGs 與測試抗菌劑對E. coli 的單一毒性作用

6 種AGs 對E. coli的單一毒性數據如表1 所示。 可以看出,測試的6 種AGs 的毒性大小較為接近,-logEC50范圍為 5.71 ~6.36 mol·L-1。 AGs 的基本結構單元由一個肌醇衍生物和至少一個氨基糖組成,其余結構還包括數個自由羥基以及至少2個氨基[16]。 該結構決定著AGs 的抑菌機制(圖1(a)):首先,AGs 通過被動的、非能量依賴的過程與革蘭氏陰性細菌外膜中的負電荷殘基靜電結合;然后,AGs 通過外膜孔蛋白通道擴散并進入周質空間[17];最后,AGs 通過能量依賴階段Ⅰ(EDP-Ⅰ)和階段Ⅱ(EDP-Ⅱ)進入細胞質并與核糖體的30S 核糖體亞基的16S rRNA 結合以造成蛋白質的錯譯從而起到抑菌作用[18-19]。

表1 試劑的理化參數和單一毒性數據Table 1 The physicochemical parameters and the single toxicity data of the reagents

續表1

基于表1 中8 種測試抗菌劑的EC50,其毒性大小排序為:四環素類抗菌劑CTC＞β-內酰胺類抗菌劑AMP＞大環內酯類抗菌劑ERY＞唑啉類抗菌劑MIT＞磺胺類抗菌劑SMX＞糖肽類抗菌劑VA＞表面活性劑類抗菌劑DTAB＞群體感應抑制劑類抗菌劑DFR。 其中毒性最大的四環素類抗菌劑 CTC 的-logEC50為7.71 mol·L-1;毒性最小的群體感應抑制劑類抗菌劑 DFR 的-logEC50為 3.83 mol·L-1。 此外,單一毒性結果還表明傳統抗菌劑的毒性作用均顯著強于新型抗菌劑。

所測試的8 種傳統和新型抗菌劑的毒性機制按照作用位點不同可以分為以下4 類。

(1)細胞壁或細胞膜抑制類(圖1(b)):糖肽類抗菌劑VA 通過與細胞壁肽聚糖的合成單體D-Ala-DAla 特異性結合,抑制細菌細胞壁肽聚糖的延伸,導致細胞死亡[20]。β-內酰胺類抗菌劑 AMP 的作用靶標是青霉素結合蛋白(PBPs),其相互作用能夠抑制參與黏肽交聯反應的轉肽酶活性進而導致肽聚糖合成受阻,導致細胞死亡[21]。 表面活性劑DTAB 因其分子中疏水的碳氫長鏈容易插入到細胞膜的磷脂雙分子層中,從而引起細胞膜損傷,最終導致細胞死亡[22]。

劉誠龍筆下，既有廣為人知的熱門人物曾國藩、左宗棠、李鴻章、翁同龢、張之洞，也有鮮為人知的冷門人物湯斌、陳廷敬；既有清官或者說好官，也有貪官乃至庸官，官場百態，或濃或淡、或明或暗呈現出來，挑揀的是文史，映照的則是現實，是豎立在反腐路上、大官小官面前的多棱鏡。

(2)DNA 抑制類(圖1(c)):磺胺類抗菌劑 SMX通過與對氨基苯甲酸(pABA)競爭性結合二氫葉酸合成酶(DHPS),從而阻礙DNA 復制,造成細胞死亡[23]。 唑啉類抗菌劑 MIT 主要通過與細菌體內DNA 的堿基結合形成氫鍵,從而破壞細胞內DNA的結構使之失去復制能力,導致細胞死亡[24]。

(3)群體感應抑制類(圖1(d)):群體感應抑制劑DFR 通過與群體感應信號分子競爭性結合群體感應調控蛋白SdiA 或LsrR 蛋白,干擾細菌的群體感應,從而抑制細菌生長[25]。

(4)蛋白質合成抑制類(圖1(e)):大環內酯類抗菌劑ERY、四環素類抗菌劑CTC 可以分別與細菌核糖體中的50S 亞基和30S 亞基結合,從而抑制蛋白質合成,最終導致細胞死亡[26-27]。

圖1 AGs 及8 種測試抗菌劑的毒性機制圖注:AGs 為氨基糖苷類抗生素。Fig.1 Toxic mechanism of AGs and 8 tested antimicrobial agentsNote: AGs stands for aminoglycosides.

2.2 AGs 和抗菌劑等毒性比與非等毒性比混合的聯合效應

2.2.1 AGs 和傳統抗菌劑等毒性比混合的聯合效應

TU RDF-1)mix-logE C50/(m ol·LTU MIT-1)mix icity ratio-logE C50/(mol·L al tox TU ABDT-1)icrobial agents in equ C50 mix-logE/(mol·L據數TU性P毒AM-1)合聯mix的比Gs and tested antim B -logE C50/(mol·L性毒TU等劑Y菌ER-1)抗試mix測Combined toxicity data of A -logE C50/(mol·L G s 與2 A TU VA表-1)mix-logE C50/(m ol·LTU C Table 2CT-1)mix-logE C50/(m ol·LTU XSM-1)mix-logE C50/(mol·L A ∶BA)1.70抗(拮Antagonism 3.91 0.50同(協Synergy)5.19)1.57抗(拮Antagonism 3.91 0.47同(協Synergy)5.98 0.21同(協Synergy)5.82)1.48抗(拮Antagonism 4.08)1.69抗(拮Antagonism 6.12 0.59同(協Synergy)5.131 ∶1NGE)1.32抗(拮Antagonism 4.02 0.40同(協Synergy)5.28—**—0.51同(協Synergy)5.89 0.25同(協Synergy)5.73)1.24抗(拮Antagonism 4.15)1.26抗(拮Antagonism 5.88 0.59同(協Synergy)5.121 ∶1RST)1.50抗(拮Antagonism 3.96 0.41同(協Synergy)5.27—**—0.54同(協Synergy)5.92 0.25同(協Synergy)5.05)1.25抗(拮Antagonism 4.15)1.23抗(拮Antagonism 6.03 0.60同(協Synergy)5.121 ∶1ONE)1.39抗(拮Antagonism 3.99 0.43同(協Synergy)5.26)1.51抗(拮Antagonism 4 0.52同(協Synergy)5.95 0.50同(協Synergy)4.97)1.37抗(拮Antagonism 4.11)1.32抗(拮Antagonism 6.03 0.53同(協Synergy)5.181 ∶1TM)1.26抗(拮Antagonism 4.03 0.37同(協Synergy)5.3)1.49抗(拮Antagonism 4 0.56同(協Synergy)5.79 0.33同(協Synergy)5.58)1.29抗(拮Antagonism 4.13)1.51抗(拮Antagonism 5.83 0.52同(協Synergy)5.171 ∶1NKA)1.65抗(拮Antagonism 3.92 0.41同(協Synergy)5.27)1.57抗(拮Antagonism 3.91 0.56同(協Synergy)5.85 0.22同(協Synergy)5.79)1.49抗(拮Antagonism 4.07)1.58抗(拮Antagonism 6.03 0.52同(協Synergy)5.171 ∶1E IS。有utually soluble, so there is no corresponding toxicity data.據數性毒應相,故互B are not m沒 溶不AB TA DT and D與EO、N EO R, NST:*S T R注Note: *

6 種AGs 與5 種傳統抗菌劑的等毒性比聯合毒性數據見表2,相應的TU 分布如圖2(a) (豎虛線左側)所示。 可以看出,AGs 與磺胺類抗菌劑SMX、大環內酯類抗菌劑ERY 和β-內酰胺類抗菌劑AMP 對E. coli聯合作用的TU 值均＜0.8,其聯合毒性效應均呈現協同作用。 基于它們的單一毒性作用機制,我們推測,AGs 作用在核糖體的30S 亞基抑制蛋白質合成,而 SMX 通過與二氫葉酸合成酶結合抑制DNA 合成,二者共同作用加速了細菌的死亡過程;ERY 能夠作用于核糖體的50S 亞基上,其與AGs 具有抑制蛋白質合成的通路一致性;AMP 作用于青霉素結合蛋白(PBPs)上造成細胞壁破裂,能夠促進AGs 滲入胞內發揮毒性作用。 因此,AGs 與SMX、ERY 和AMP 的聯合毒性效應產生協同作用。

圖2 AGs 與測試抗菌劑的TU 值注:(a) 等毒性比混合;(b) 非等毒性比混合。Fig.2 TU values for AGs and tested antimicrobial agentsNote: (a) The equal toxicity ratio mixing; (b) The non-equal toxicity ratio mixing.

AGs 與四環素類抗菌劑CTC 和糖肽類抗菌劑VA 對E. coli聯合作用的TU 值均＞1.2,其聯合毒性效應呈現拮抗作用。 基于它們的單一毒性作用機制,我們推斷,CTC 作用于核糖體30S 亞基上對E.coli產生抑制作用,其與AGs 具有相同的靶位點產生了特異性競爭;VA 不能穿透革蘭氏陰性菌外膜,在進入細胞時將細胞膜上的孔蛋白堵塞,可能阻止AGs 進入細胞[28]。 因此,AGs 與 CTC 和 VA 的聯合毒性效應呈現拮抗作用。

2.2.2 AGs 和新型抗菌劑等毒性比的聯合效應

6 種AGs 與3 種新型抗菌劑的等毒性比聯合毒性數據見表2,相應的TU 分布如圖2(a) (豎虛線右側)所示。 可以看出,AGs 與唑啉類抗菌劑 MIT 對E. coli聯合作用的TU 值均＜0.8,其聯合毒性效應呈現協同作用。 基于它們的單一毒性作用機制,我們推測,AGs 作用在核糖體的30S 亞基時,抑制細菌蛋白質合成,而MIT 通過與細菌體內DNA 的堿基結合形成氫鍵破壞細胞內DNA 的結構,二者共同作用能夠協同抑制細菌的生長。 因此,AGs 與MIT的聯合毒性呈現協同作用。

AGs 與表面活性類抗菌劑DTAB 和群體感應抑制劑類抗菌劑DFR 對E. coli的聯合毒性效應呈現拮抗作用。 基于它們的單一毒性作用機制,我們推斷,DTAB 疏水的碳氫長鏈插入到細胞膜的磷脂雙分子層時,能夠阻止AGs 進入細胞產生毒性作用;AGs 通過抑制蛋白質合成使群體感應調控蛋白減少,降低DFR 與群體感應蛋白(SidA 或LsrR)相互作用。 因此,AGs 與 DTAB 和 DFR 的聯合毒性呈現拮抗作用。

基于上述研究結果,可以看出AGs 與傳統抗菌劑中的四環素抗菌劑CTC、糖肽類抗菌劑VA 以及與新型抗菌劑中的表面活性類抗菌劑DTAB 和群體感應抑制劑類抗菌劑DFR 在等毒性比下呈現拮抗作用,說明這些產生拮抗作用的混合物暴露在環境中能夠降低單一抗菌劑的毒性作用,可能降低單一抗菌劑的環境風險。

AGs 與傳統抗菌劑中的磺胺類抗菌劑SMX、大環內酯類抗菌劑ERY 和β-內酰胺類抗菌劑AMP 以及與新型抗菌劑中的唑啉類抗菌劑MIT 在等毒性比混合下均呈現協同作用,說明當AGs 與這些抗菌劑混合暴露在環境中時,其暴露風險大于單一抗菌劑的環境暴露風險。 那么AGs 與產生這些抗菌劑在非等毒性比作用下還可以產生協同作用嗎? 這些問題還有待進一步討論。

2.2.3 AGs 與傳統抗菌劑非等毒性比混合的聯合效應

AGs 與磺胺類抗菌劑SMX、大環內酯類抗菌劑ERY 和β-內酰胺類抗菌劑 AMP 在 1 ∶5 和 5 ∶1 毒性比的實驗結果如表3 所示,相應的TU 分布如圖2(b)(豎虛線左側)所示,由表 3 可知,AGs 與 SMX 和 AMP對E.coli非等毒性比的聯合毒性效應均呈現協同作用。 AGs 與 ERY 的結果中,硫酸新霉素(NEO)與ERY 在 1∶5 和 5∶1 毒性比混合時呈現相加作用,以及妥布霉素(TM)與ERY 在1∶5 毒性比混合作用呈現拮抗作用,其余情況下聯合毒性效應均為協同作用。 此外,根據TU 值的大小(TU 值越小表明協同效果越強),可以看出毒性比的改變會影響協同效果,從表3和圖2(b) (豎虛線左側)可以看出,AGs 與SMX、ERY和 AMP 在毒性比 1∶5 時較毒性比 1∶1 和 5∶1 時呈現更好的協同作用,可能產生更大的環境暴露風險。

2.2.4 AGs 與新型抗菌劑非等毒性比的聯合效應

AGs 與唑啉類抗菌劑 MIT 在 1 ∶5 和 5 ∶1 毒性比的實驗結果如表3 所示,相應的TU 分布如圖2(b) (豎虛線右側)所示,由表 3 可知,AGs 與 MIT 對E. coli的非等毒性比聯合毒性效應均呈現協同作用。 此外,根據TU 值的大小,可以看出毒性比的改變會影響協同效果,由表3 和圖2(b) (豎虛線右側)可知,AGs 與 MIT 在毒性比 1 ∶5 時較毒性比 1 ∶1 和5 ∶1 時呈現更好的協同作用,可能產生更大的環境暴露風險。

表3 AGs 與測試抗菌劑非等毒性比的聯合毒性數據Table 3 Combined toxicity data of AGs and tested antimicrobial agents in non-equal toxicity ratio

基于以上研究結果,AGs 與磺胺類抗菌劑SMX、β-內酰胺類抗菌劑 AMP 和唑啉類抗菌劑MIT 在毒性比 1 ∶1、1 ∶5 和 5 ∶1 時對E.coli的聯合毒性效應均呈現協同作用。 此外,AGs 與抗菌劑的毒性比為 1 ∶5 時較 1 ∶1 和 5 ∶1 時的聯合暴露風險更大。 以往的研究表明,AGs 與抗菌劑聯合暴露時,抗菌劑劑量增加增大了它們的聯合暴露風險。 Delis 等[29]在研究體外抗菌藥物相互作用時,阿米卡星和2 種氟喹諾酮類藥物之間的聯合毒性效應部分觀察到協同作用,但在氟喹諾酮濃度增加后,協同效果更為明顯;N?hr-Meldgaard 等[30]在研究白藜蘆醇與AGs 中的慶大霉素對金黃色葡萄球菌的協同作用時發現,在白藜蘆醇劑量增加的情況下,會產生更好的協同效果;Mitchell 等[31]研究托馬替丁與AGs 聯合使用的抗菌活性時,發現它們之間的協同效果僅在托馬替丁增加時更加明顯。 因此,我們推測,當AGs 和與其具有協同作用的抗菌劑混合暴露時,提高混合體系中這種抗菌劑相對于AGs 的比例,可能使得AGs 與抗菌劑同時作用時AGs 更容易進入細胞并增強AGs 對細菌的毒性作用。 所以,從環境風險看,AGs 和與其具有協同作用的抗菌劑在環境中共同暴露會提升對生物體的毒性作用;此外,當抗菌劑在混合體系中相較于AGs 具有更高的比例時,其混合物的環境風險會進一步增加。

綜上,本文對AGs 與抗菌劑在不同毒性比下對E. coli的聯合毒性效應進行探究,研究結果總結如下:(1) AGs 與傳統抗菌劑中的四環素抗菌劑CTC、糖肽類抗菌劑VA,與新型抗菌劑中的表面活性劑類抗菌劑DTAB 和群體感應抑制劑類抗菌劑DFR在等毒性比時均呈現拮抗作用。 這些產生拮抗作用的抗菌劑暴露在環境中可減弱單一毒性風險,從而降低環境風險;(2) AGs 與傳統抗菌劑中的磺胺類抗菌劑SMX、大環內酯類抗菌劑ERY 和β-內酰胺類抗菌劑AMP,與新型抗菌劑中的唑啉類抗菌劑MIT在等毒性比下均呈現協同作用;(3) AGs 與SMX、AMP 和 MIT 在 1 ∶5 和 5 ∶1 毒性比時的聯合毒性效應呈現協同作用,且AGs 與抗菌劑的毒性比為1 ∶5時的效果較 1 ∶1 和 5 ∶1 時的效果好。 所以,在環境風險方面,具有協同作用的AGs 與抗菌劑在環境中共同暴露時,會提高單一藥物對生物體的毒性作用;同時,混合體系中抗菌劑相對于AGs 比例的提高可能會進一步增強聯合暴露的環境風險,對人類健康以及生態環境造成威脅。 本研究能夠為環境中AGs與抗菌劑聯合暴露的風險評估提供參考與支撐。