噻蟲胺對大鼠性腺系統的影響

魏若瑾, 常靜, 楊璐, 潘一帆, 劉科陽, 劉文濤, 王會利,* , 王瀛寰,朱莉飛

1. 中國科學院生態環境研究中心,北京 100085

2. 中國科學院大學,北京 100049

3. 北京市水產科學研究所,北京 100086

作為傳統農業大國,我國的農藥使用量是世界平均水平的2.5 倍~3 倍[1]。 每年全球農藥使用量約30 億kg[2],作為陸地環境的主要污染物[3],大量殘留農藥進入土壤或者揮發到大氣,進入土壤中的農藥再經滲透作用進入水體,破壞生態系統,威脅人類和動物的健康生存。 新煙堿類殺蟲劑于20 世紀90年代開始商品化,是自擬除蟲菊酯類農藥商品化后進入市場的增長最快的一類殺蟲劑[4]。 該類化合物的作用靶點是哺乳動物和昆蟲膽堿能神經系統中的煙堿乙酰膽堿受體(nAChR),與昆蟲nAChR 的親和力很高,又不被乙酰膽堿酯酶分解,因此使昆蟲神經系統持續興奮,干擾中樞神經信號的正常傳導,殺滅害蟲。

許多農藥已被證明具有內分泌干擾作用,能夠干擾內分泌系統的一種或多種功能,對生物體和后代造成不利影響[5]。 因此,研究農藥的內分泌干擾效應具有重要意義。 噻蟲胺(clothianidin, CLO)是一種典型的新煙堿類殺蟲劑,對害蟲有觸殺、胃毒及內吸活性[6]。 CLO 被廣泛應用于防治害蟲,如薊馬、粉虱、蚜蟲、潛葉蟲和鞘翅目昆蟲[7]。 因為新煙堿類物質對脊椎動物的煙堿乙酰膽堿受體的親和力比較低,所以對脊椎動物的毒性較低[8]。 但已有研究證明新煙堿類殺蟲劑會對脊椎動物產生內分泌干擾效應。例如Pandey 等[9]研究了吡蟲啉染毒對紅文鳥生殖行為的影響,發現在繁殖階段,鳴叫和配對行為逐漸減少直至完全消失。 Caron-Beaudoin 等[10]研究發現,在胚胎聯合培養模型中的CLO 會引起細胞色素P450酶CYP19 的強表達,并影響雌激素的合成。 Wang等[11]對麗斑麻蜥染毒CLO,發現CLO 會在性腺內積累并干擾性腺軸相關基因表達,影響睪酮和雌二醇的濃度。 因此,CLO 可能是潛在的內分泌干擾物質。

外源物質可以通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG axis)的反饋機制直接影響內源性激素的產生[12]。 睪酮(testosterone,T)和雌二醇(estradiol, E2)是重要的性類固醇激素,主要分泌于性腺中,促進性腺成熟,發展第二性征,對生殖系統具有重要的調控意義。 基于此,本研究將 SD 大鼠分別按照50、150 和250 mg·kg-1CLO 的濃度進行染毒,通過分析CLO 在大鼠體內的富集代謝以及28 d 后對大鼠性腺組織的損傷情況和血液中性腺激素的變化,探討CLO 對大鼠HPG 軸的可能影響以初步探討新煙堿農藥對大鼠內分泌系統的干擾作用。

1 材料與方法(Materials and method)

1.1 試劑和儀器

CLO(純度＞98%)購自湖南海利化工有限公司。色譜純級別的乙腈、甲酸、無水乙醇均購自迪馬科技有限公司(北京)。 Elisa 試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

儀器:TSQ Quantum Access MAX 高效液相色譜-質譜聯用儀(賽默飛世爾科技公司,美國);可調式移液器(艾本德,德國);Sigma 3K15 高速冷凍離心機(默克,德國);RE-2000 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠,中國)。

1.2 大鼠飼養

成年Sprague-Dawley (SD)大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證編號:SCXK(京)2016-0006。 大鼠飼養于北京萬合科技有限公司SPF 級動物房中,飼養許可證編號:SYXK(京)2020-0008。 控制大鼠飼養條件為溫度20 ~26℃,光暗比12 h ∶12 h,試驗前大鼠進行7 d 檢疫觀察,合格大鼠用于試驗。 染毒前大鼠隔夜禁食,飲水不限。

1.3 劑量選擇和實驗設計

CLO 的大鼠經口灌胃 LD50為＞5 000 mg·kg-1,選擇 LD50的 1%(50 mg·kg-1),3%(150 mg·kg-1)和5%(250 mg·kg-1)作為 3個染毒濃度。 把 CLO 配成混懸液用于灌胃。 把羧甲基纖維素鈉粉末緩慢加入60 ℃蒸餾水中,邊加邊攪拌,配成均一透明的溶液(0.5%羧甲基纖維素鈉),放涼后用于配藥。 CLO 粉末倒入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中超聲,邊加邊攪拌,配成混懸液,灌胃期間持續攪拌。

48 只大鼠,雌雄各24 只,雌鼠和雄鼠都分別隨機分成4 組:溶劑對照組(灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉)、低劑量CLO 組、中劑量 CLO 組和高劑量 CLO 組,共 8 組(雌、雄各 4 組),每組 6 只。 每天經口灌胃,持續28 d 后解剖,取大鼠的腦、肝、性腺(睪丸和卵巢)以及血清保存于-20 ℃,用于檢測CLO 濃度;一部分性腺保存于4%多聚甲醛溶液中,用于組織病理分析;一部分血清保存于-80 ℃,用于激素水平分析。

1.4 大鼠組織中CLO 濃度分析

在血清和腦、肝、性腺的勻漿中加入10 mL 乙腈,渦旋 3 min,超聲振蕩20 min,然后10 000 r·min-1離心5 min,取上清液。 重復以上操作,并將上清液合并,在35 ℃用真空旋轉蒸發儀將溶劑蒸干,然后用1 mL 乙腈溶解,通過0.22 μm 微孔過濾膜過濾后上機檢測。

使用TSQ Quantum Access MAX 高效液相色譜-質譜聯用儀(賽默飛世爾科技公司),定量分析CLO 含量。 采用 Thermo C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫40 ℃,進樣量10 μL,流動相梯度洗脫條件如表1 所示。 采用電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式,毛細管溫度350 ℃,毛細管電壓3 500 V,蒸發溫度200 ℃,鞘氣流速為207 kPa,輔助氣流速為34 kPa,監測方式為選擇反應監測(SRM),定性離子對(m/z)為 250.200/131.966 和 250.200/169.052,定量離子對(m/z)為250.200/169.052。

表1 流動相梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of mobile phase

進樣過程進行質量控制,每15個樣品測定一次標準曲線,每5個樣品之間測一個空白樣。

1.5 組織病理學分析

將解剖得到的大鼠性腺組織剪下一小部分,用4%多聚甲醛固定,切成小塊,放入包埋盒中,用紗布包裹,流水沖洗一晚,用50% ~100%的乙醇進行梯度脫水,加二甲苯透明劑,然后將組織浸蠟。 用輪轉式切片機把包埋好的蠟塊切出4 μm 的切片,用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,胞核呈藍色,胞漿呈紅色,紅細胞呈桔紅色,其他成分呈深淺不同的紅色,用光學顯微鏡觀察組織病理損傷情況。

1.6 性激素水平的檢測

把大鼠麻醉后,進行腹腔靜脈取血,把血液收集到促凝管中,4 ℃靜置5 min,在4 ℃下4 000 r·min-1離心10 min,取上清液保存于-80 ℃。 使用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測血清中性激素T 和E2 的濃度。 板內和板間變異系數均＜10%,試劑盒測定的靈敏度T 為0.17 ng·mL-1,E2 為1 pg·mL-1。 用酶標儀在450 nm 波長處測吸光度OD 值,激素濃度與OD 值負相關,通過繪制雙對數曲線計算出血清中T 和E2 的濃度。 為了便于分析,激素含量用相對于對照組激素濃度的倍數來表示。

1.7 數據分析與統計

使用SPSS24.0 軟件進行統計分析,采用單因素方差分析方法比較組間差異。 *P＜0.05 表示具有統計學差異。

2 結果(Results)

2.1 CLO 在大鼠腦、肝、性腺和血清中的分布

CLO 染毒28 d 后在腦、肝、性腺和血清中的分布如圖1 所示。 各染毒組的CLO 殘留濃度為:低劑量雄鼠組1.44 mg·kg-1,低劑量雌鼠組1.36 mg·kg-1;中劑量雄鼠組3.20 mg·kg-1,中劑量雌鼠組2.76 mg·kg-1;高劑量雄鼠組64.52 mg·kg-1,高劑量雌鼠組58.09 mg·kg-1。 比較分析 3個不同劑量染毒組,發現雄性大鼠體內的CLO 濃度一直高于雌性大鼠。低、中劑量組雌雄大鼠各組織中CLO 的濃度從大到小的順序是:血清＞肝臟＞性腺＞腦。 高劑量雌鼠組,雖然CLO 在肝臟中的富集比例明顯減小,但仍保持低、中劑量組的分布規律。 高劑量雄鼠組,CLO 在各組織中的濃度從大到小的順序是:血清＞性腺＞肝臟＞腦。

圖1 噻蟲胺(CLO)在大鼠血清、腦、肝和性腺組織中的分布Fig.1 Distribution of clothianidin (CLO) in serum,brain, liver and gonad tissues of rat

2.2 性腺組織病理學

經過28 d 的CLO 染毒后,觀察到了大鼠性腺(睪丸和卵巢)的病理學變化(圖2 和圖3)。 在雄鼠對照組中,正常的大鼠睪丸組織被膜完整,生精小管內各級生精細胞排列整齊,結構較為清晰(圖2(a))。 與對照組相比,低、中劑量染毒組未見異常病變(圖2(b)和2(c)),高劑量組睪丸周邊局部區域部分曲細精管可見生精細胞變性壞死脫落于管腔內,有的曲細精管上皮嚴重變性壞死,腔內充滿壞死的無結構紅染的團塊(圖2(d))。

圖2 雄性大鼠睪丸細胞切片注:(a)對照組;(b) CLO 低劑量染毒組;(c) CLO 中劑量染毒組;(d) CLO 高劑量染毒組;圓圈代表生精細胞壞死,箭頭代表曲細精管上皮細胞壞死。Fig.2 Representative histology of the testis of male ratNote: (a) Control; (b) Low-dose CLO treated group; (c) Medium-dose CLO treated group; (d) High-dose CLO treated group; circle represents necrosis of spermatogenic cells and arrow represents necrosis of seminiferous epithelial cells.

圖3 雌性大鼠卵巢細胞切片注:(a)對照組;(b) CLO 低劑量染毒組;(c) CLO 中劑量染毒組;(d) CLO 高劑量染毒組;圓圈代表間質血管明顯充血。Fig.3 Representative histology of the ovaries of female ratNote: (a) Control; (b) Low-dose CLO treated group; (c) Medium-dose CLO treated group; (d) High-dose CLO treated group ;circles represent significant congestion of interstitial blood vessels.

雌性大鼠對照組卵巢皮質中有不同數量的卵泡和黃體,其間為梭形的成纖維細胞及網狀纖維,髓質中有富含血管的疏松結締組織。 與對照組相比,低、中劑量組卵巢未見異常病變;高劑量組間質血管明顯充血,其余無異常病變。

2.3 血清性激素水平

CLO 染毒28 d 后,不同劑量組血清性激素(T和E2)水平如圖4 所示。 為了便于分析,激素含量用相對于對照組激素濃度的倍數來表示。 雄性大鼠染毒組,T 和E2 濃度均顯著高于對照組,且中劑量組濃度均顯著高于低劑量組,高劑量組濃度均顯著低于中劑量組,呈現出非單調劑量效應關系。 雌性大鼠染毒組,低、中劑量組大鼠血清中的T 激素水平與對照組相比無顯著差異,高劑量組濃度顯著低于對照組;3個劑量組大鼠血清中的E2 激素水平與對照組均無顯著差異。

圖4 CLO 染毒28 d 后血清中性激素睪酮(T)和雌二醇(E2)的含量注:* 相對于對照組P＜0.05,a 相對于低劑量組P＜0.05,b 相對于中劑量組P＜0.05。Fig.4 Serum concentration of testosterone (T) and estradiol(E2) after CLO exposure for 28 d in male and female ratsNote:* P＜0.05 relative to control, a P＜0.05 relative to low dose, b P＜0.05 relative to medium dose.

3 討論(Discussion)

大鼠連續28 d 染毒CLO,檢測肝、腦、性腺和血清中CLO 的濃度,發現不同劑量的暴露組中,雄鼠體內的CLO 濃度一直高于雌鼠,CLO 更容易在雄鼠體內富集。 在低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量組,CLO 在雌、雄大鼠體內的殘留量較小,主要分布在血清和肝臟中,各組織中濃度從大到小的順序是:血清＞肝臟＞性腺＞腦。 藥物通過跨膜運輸和擴散進入血液循環系統,隨后通過血液的流動被輸送到各個組織中,肝臟內具有豐富的氧化還原酶,是許多外源性物質解毒的最佳場所,因此大量CLO 被輸送到肝臟中進行代謝。 在高劑量組(250 mg·kg-1),CLO 在大鼠體內有較高的殘留量,除了血清和肝臟,在性腺中也大量富集,尤其是雄鼠睪丸中,平均濃度達到14.34 mg·kg-1,超過了肝臟中的濃度,過高的殘留濃度可能會對睪丸的正常生理功能造成影響。

在高倍鏡下觀察大鼠性腺組織的切片,與對照組相比,低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量組睪丸沒有異常病變(圖2(b)和2(c)),高劑量組(250 mg·kg-1)睪丸嚴重病變,部分細胞變性壞死(圖2(d))。組織細胞發生壞死后,物質代謝停止,功能完全喪失,出現一系列形態學改變,壞死是一種不可逆的病理過程,因此250 mg·kg-1CLO 染毒會對大鼠睪丸造成病理損傷,從而可能導致生殖障礙,已有研究表明新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉能夠使成年雄性大鼠產生生殖障礙[13-14]。 雌性大鼠3個染毒組中,卵巢細胞均無異常病變,CLO 對雌鼠卵巢正常結構影響不大。

許多環境污染物通過改變內分泌系統的發育和功能來影響動物的繁殖。 暴露此類污染物會影響性激素水平或阻斷/激活類固醇激素受體,從而對人類和野生動物造成不利的健康后果[10]。 在脊椎動物中,性類固醇激素(T 和E2)在睪酮和卵巢中合成、分泌,參與調節生殖系統發育、維護第二性征等一系列過程。 因此,T 和E2 水平是評估CLO 染毒對大鼠性腺影響的重要指標。 低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量CLO 染毒組中,與對照組相比,雄性大鼠性激素(T 和E2)含量均顯著升高,且中劑量組性激素濃度顯著高于低劑量組,性激素水平與性腺中的CLO 殘留濃度呈現出正相關的趨勢,說明CLO 染毒促進雄鼠性激素合成和分泌。 在高劑量染毒組(250 mg·kg-1)中,雄鼠性激素含量雖然也高于對照組,但卻不符合低、中劑量組的趨勢,結合病理學分析,導致此結果的原因可能是250 mg·kg-1染毒使雄鼠睪丸部分細胞壞死,無法進行正常的生命活動,所以高劑量(250 mg·kg-1)CLO 對雄鼠性激素分泌的促進作用有限。 低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量的CLO 染毒對雌鼠性激素水平無影響,高劑量(250 mg·kg-1)的CLO 染毒會使雌鼠血清中T 含量顯著降低,而E2 濃度無明顯變化,說明CLO 染毒可能會抑制雌鼠T 分泌,而對E2 作用不顯著。

綜上,在本試驗劑量設置和實驗條件下,3個劑量CLO 染毒均促進雄性大鼠T 和E2 分泌,CLO 高劑量染毒(250 mg·kg-1)會在雄性大鼠睪丸中大量富集,并導致生精細胞和曲細精管上皮細胞變性壞死,影響大鼠睪丸的正常生理功能;同時不同劑量CLO染毒不會對雌鼠造成明顯的病理損傷,低(50 mg·kg-1)、中(150 mg·kg-1)劑量 CLO 染毒對雌鼠性激素無顯著影響,而高劑量CLO 染毒會抑制雌性大鼠T分泌。 由以上結果可知3個劑量CLO 染毒均對雄性大鼠性腺系統的正常生理功能產生影響,250 mg·kg-1CLO 染毒對雌性大鼠性腺系統的生理功能可能產生一定影響。 CLO 可能是潛在的內分泌干擾物。