水環境中農藥類污染物的內分泌干擾效應研究

逯南南, 孫韶華, 王明泉, 許燕, 趙清華, 宋艷, 賈瑞寶

山東省城市供排水水質監測中心,濟南 250101

內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是一類重要的環境污染物,能夠影響生物體的內分泌系統而破壞生物體內激素分泌機能。 近年來,水環境中EDCs 的存在引起研究者的廣泛關注。世界各國的飲用水水源中均有EDCs 檢出[1-6],如中國、西班牙、美國、亞美尼亞、馬來西亞和英國。 在這些環境EDCs 中,內分泌干擾類農藥(endocrine disrupting pesticides,EDPs)及其代謝產物占有非常高的比例。 EDPs 是一類外源性干擾內分泌系統的農藥,可干擾人類及其他動物內分泌系統的諸多環節,從而使生物體產生異常效應[7]。 世界自然基金會發布的《環境中被報告具有生殖和內分泌干擾作用的化學物質清單》(1999年)中,125 種 EDCs 中農藥類污染物有86 種,占比60%以上,包括有機磷類、擬除蟲菊酯、取代苯類和含氮雜環類等,常見的六六六、滴滴涕、多菌靈和林丹等均屬于EDPs[7-8]。 據報道,EDPs 可產生類雌激素及抗雌激素、類雄激素及抗雄激素、類甲狀腺素及抗甲狀腺素等多種類型內分泌干擾效應,其中以雌激素效應和抗雄激素效應最為常見[8]。

目前關于EDPs 的生物檢測技術主要涉及活體試驗和離體試驗2個方面,體內試驗以卵生脊椎動物、爬行動物和兩棲動物等活體動物為對象;體外試驗則包括受體結合實驗、體外芳香酶活性抑制實驗、細胞培養實驗和分子生物學檢測技術等[7]。 體外試驗中,基于哺乳動物細胞的化學激活熒光素酶基因表達法(CALUX)測試技術和重組酵母細胞測試系統(YAS、YES 等)在內分泌干擾效應篩查上應用廣泛。重組酵母細胞測試系統對無菌條件沒有嚴格要求,更適用于復合樣品的內分泌干擾效應篩查[9];CALUX 采用哺乳動物細胞測試對測試環境要求較為嚴格,但操作程序簡單、快速、適用范圍廣,分析費用低,檢測周期短,檢測靈敏度和準確性高,在EDPs的篩查方面具有獨特的優勢[10]。 Seeger 等[11]同時采用基于哺乳動物細胞系的CALUX 技術和重組酵母細胞測試系統(YAS)進行了殺菌劑的抗雄激素效應研究,結果表明,2 種測試技術都可以成功應用于殺菌劑抗激素效應的評價,其中CALUX 技術對物質的敏感性略高,不易受到測試物質細胞毒性的影響。

通過液相色譜-飛行時間質譜從黃河下游地區水源水中篩查鑒定出包括殺蟲劑和除草劑等多種農藥類污染物(表1)。 關于這些化合物的內分泌干擾效應(雌激素和雄激素)研究,僅阿特拉津、多菌靈等少數化合物有相關報道,而且不同的測試方法報道結果也存在差異。 對非性激素功能如腎上腺皮質激素活性的干擾作用更是鮮有報道。

表1 測試化合物相關信息Table 1 Information of the tested compounds

通過與激素的特定受體直接結合激活受體通路,進而產生多種不同的毒性效應是內分泌干擾物的重要作用途徑。 本研究采用CALUX 技術對水源水中篩查鑒定出的農藥污染物雌激素、雄激素和糖皮質激素受體介導的綜合激素效應進行了測試評估,為水環境中農藥類污染物健康風險評估提供支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器設備

液相色譜-飛行時間質譜(G2-XS-QTOF,美國Waters 公司);固相萃取儀(AUTO SPE 06,中國睿科集團股份有限公司);微孔板式化學分光儀(LB960,德國Berthold Centro 公司);微孔板讀板機(Emax Plus,美國 Molecular Devices 公司);生物安全柜(AC2-4S1,新加坡 ESCO 公司);二氧化碳培養箱(HERA cell 150i,美國Thermo 公司);組織培養用顯微鏡(CKX41,日本奧林巴斯株式會社)。

1.2 試劑及培養基

CALUX 測定標準物質濃度系列(雌二醇、二氫睪酮、地塞米松)購自荷蘭Biodetection Systems B.V.(BDS)公司;甲醇、二甲基亞砜(DMSO)、正己烷、乙酸乙酯以及測試化合物(表1)均購自Sigma 公司。所有待測化合物的原液均溶于DMSO 中,濃度為10-2mol·L-1,保存于-20 ℃備用。 根據預實驗結果,所有的測試化合物都用相應的培養基稀釋至實驗濃度用于測試。 DMSO 在培養基中的最終濃度不超過0.1%。 DMEM/F12、DMEM 高糖培養基均購于美國GIBCO 公司。

1.3 液相色譜-飛行時間質譜篩查

(1)樣品前處理

HLB 固相萃取,依次用10 mL 甲醇和10 mL 純水活化,取1 000 mL 水樣過柱,流速10 mL·min-1,上樣完成后用10 mL 純水淋洗固相萃取柱,氮吹30 min 干燥后,以5 mL 甲醇洗脫,氮吹定容至1 mL,上機測試。

(2)儀器工作條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm)。 流動相:A 相(0.1% 甲酸-水溶液)、B相(0.1%甲酸-乙腈溶液)。 洗脫模式及洗脫流速:采用梯度洗脫(表2),洗脫速率為0.2 mL·min-1,柱箱溫度30 ℃,進樣體積5 μL。 電噴霧離子源,正、負離子模式,MSe 掃描,采集范圍(m/z)50 ~1 200。

表2 流動相梯度條件Table 2 Gradient condition of mobile phase

1.4 細胞系和細胞培養

生物測定細胞系由BDS 公司提供,其中ERCALUX 生物測定采用人乳腺癌細胞系(T-47D),AR-CALUX 和GR-CALUX 生物測定采用人骨肉瘤細胞系(U2OS)。 所有細胞系培養基為添加10%FBS 的DMEM/F12,于75 cm2的組織培養瓶中,37℃、5% CO2條件培養。

1.5 細胞增殖毒性測定

采用噻唑藍-溴化四唑鹽(MTT)法進行測定[12]。細胞鋪板密度為1×104個·mL-1,鋪板24 h 后進行染毒。 染毒試驗設空白對照組(加入相同體積的培養基)、溶劑對照組(加入相同體積的DMSO)和化合物染毒組(加入各測試化合物的DMSO 溶液),每組設6個平行,測試化合物染毒終濃度為10-6~10-4mol·L-1。 染毒處理 24 h 后加入 MTT 于 570 nm 下測定光吸收值。 細胞存活率按下列公式計算:細胞存活率=實驗組 OD 值/對照組 OD 值×100%[13]。

1.6 內分泌干擾效應測試

根據ISO17025 認證推薦的標準操作方法進行檢測[14]。 首先,將細胞懸浮液稀釋至105個·mL-1密度置于96 孔板中,37 ℃、5% CO2條件下孵育16 h。移出培養基后,將預先制備的含特定濃度標準參照物或樣本的培養基填充至微孔板,每組設3個平行。孵育24 h 后,從微孔板中移出所有培養基,每孔加入30 μL 細胞消散試劑并充分混勻,利用微孔板式化學分光檢測儀測定螢光素酶活性。 對照標準參照物系列的熒光強度,制作劑量-響應曲線,得出樣品中不同 EDCs 的當量值,分別使用 17β-雌二醇(E2)、二氫睪酮(DHT)、地塞米松(DEX)毒性當量來表征雌激素、雄激素和腎上腺皮質激素的內分泌干擾效應。

1.7 數據分析

使用SPSS 軟件單因子方差分析法進行試驗組間數據的差異顯著性檢驗。

2 結果(Results)

2.1 細胞毒性

T-47D 細胞系毒性測試結果顯示,阿特拉津、嘧菌酯、腈菌唑、乙嘧酚、芐嘧磺隆和煙嘧磺隆6 種農藥在 1×10-4mol·L-1濃度下對 T-47D 細胞增殖有明顯的促進或抑制作用,非細胞毒性效應濃度均為1×10-5mol·L-1。 其他測試化合物在 1×10-4mol·L-1濃度下均無顯著的細胞毒性效應。 而U2OS 細胞系毒性測試結果顯示,在1×10-4mol·L-1濃度下,僅多菌靈、乙嘧酚和嘧菌酯3 種濃度具有顯著的細胞毒性效應,細胞存活率分別為(74±4)%、(35±8)%和(27±9)%,其他測試化合物均無顯著細胞毒性效應。多菌靈、乙嘧酚和嘧菌酯3 種農藥對U2OS 細胞系的最高非細胞毒性效應濃度分別為1×10-4、1×10-4和1×10-4mol·L-1。 所有化學物質的無顯著細胞毒性效應濃度用于后續的內分泌干擾效應測試,結果如表3 所示。

表3 測試化合物的細胞毒性效應Table 3 Cytotoxicity of the tested compounds

2.2 內分泌干擾效應測試

2.2.1 雌激素受體激動和拮抗效應

在試驗濃度下,所有測試物均不能誘導螢光素酶活性,說明均不具有雌激素受體激動效應。 拮抗試驗中采用濃度為3×10-9mol·L-1的 E2 與待測化合物共暴露測試,其中僅環莠隆與E2 共暴露時,檢測到熒光強度顯著降低,顯示雌激素受體拮抗效應,其余14 種測試物均未顯示雌激素受體拮抗效應。撲草凈在拮抗反應試驗中檢測到熒光信號增強。

2.2.2 雄激素受體激動和拮抗效應

所有測試物在非細胞毒性劑量下均未表現出顯著的熒光誘導作用,表明它們均不具有雄激素受體激動效應。 拮抗試驗中采用濃度為3×10-8mol·L-1的DHT 與待測化合物共暴露測試,多效唑、戊唑醇和三環唑顯著降低DHT 誘導的熒光反應,表現出雄激素受體拮抗效應。 化合物在試驗最高濃度下分別抑制DHT 介導的反應62%、91%和72%(圖1(a)),劑量效應曲線如圖1(b)所示。 3 種農藥的EC50分別為 8.2×10-5、3.8×10-5和 4.7×10-5mol·L-1。 其余 12種測試物均未顯示雄激素受體拮抗劑活性。

圖1 雄激素受體拮抗反應測試注:(a)測試物在最高濃度下的拮抗反應(3×10-8 mol·L-1),(b)雄激素受體拮抗劑化合物的劑量-反應曲線;DHT 表示二氫睪酮。Fig.1 Test of androgenic receptor antagonist responseNote: (a) Androgenic antagonist response at the highest concentration (3×10-8 mol·L-1), (b) Dose-response curves of the androgenic antagonist compounds; DHT stands for dihydrotestosterone.

2.2.3 腎上腺皮質激素受體激動和拮抗效應

與雄激素和雌激素受體激動效應測試結果類似,沒有一種測試物表現出明顯的皮質激素受體激動效應。 與DEX 的共孵育結果顯示,在1×10-4mol·L-1濃度下,甲霜靈、撲草凈、三環唑和阿特拉津顯著減弱陽性物質DEX 誘導的熒光反應信號,顯示出弱皮質激素受體拮抗活性。 4 種化合物對DEX 誘發熒光反應的抑制率為12% ~21%(圖2)。

圖2 測試物在最高濃度下的皮質激素受體拮抗反應(1×10-4 mol·L-1)注:DEX 表示地塞米松。Fig.2 Androgenic antagonist response at the highest concentration (1×10-4 mol·L-1)Note: DEX stands fordexamethasone.

農藥類化合物內分泌干擾效應測試結果顯示,在非細胞毒性劑量下,水源水中15 種農藥內分泌干擾效應測試未篩查出激素受體激動劑,雌激素受體拮抗劑1 種(環莠隆)、雄激素受體拮抗劑3 種(多效唑、戊唑醇和三環唑)、糖皮質激素受體拮抗效應劑4 種(甲霜靈、撲草凈、三環唑和阿特拉津),如表4 所示。

3 討論(Discussion)

國內外學者應用重組酵母細胞測試系統和CALUX 方法進行了大量農藥類物質內分泌效應的篩查研究[12-20],所涉及的干擾效應類型主要為雌激素效應和抗雄激素效應。 方琪等[8]系統梳理了涵蓋有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯和三唑類等多種類型的85 種EDPs 毒性效應的測試情況,結果顯示EDPs 存在雌激素、雄激素和甲狀腺激素等多種類型內分泌干擾效應,其中測試方法也以CALUX 技術和重組酵母測試系統應用最多。

本研究以高分辨率質譜法在引黃水源水中篩查鑒定出的三嗪類、三唑類和磺酰脲類等多種類型的農藥類化合物為目標,通過體外受體結合實驗對其潛在的內分泌干擾效應進行了研究。 研究共涉及15 種農藥化合物,除阿特拉津外,其他均為《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)未列入的指標。 這些目標化合物中阿特拉津、二丁基阿特拉津、腈菌唑、戊唑醇和多菌靈等已被證實具有內分泌干擾效應(表5),已有報道中所用篩查方法的不同,篩查結果也不盡相同。 其余物質未見相關內分泌測試報道。

表5 部分農藥的內分泌干擾效應Table 5 Endocrine disrupting effects of some pesticides

pounds果結試esticide com測f p應效擾干泌分內物合化類藥ocrine disrupting effects o 4 農f end表lts o Resu Table 4劑抗R))拮Antagonist(G體劑受動素腎Glucocorticoid receptor (GR激Agonist激質皮腺-1)上/(mol·L -1)度濃Concentration/(mol·L拮劑抗)Antagonist R)劑(A 動體激Agonist受素激雄Androgen receptor (AR-1)/(mol·L濃Concentration/(mol·L -1)度 劑抗拮Antagonist)R)劑(E 動體激Agonist受素激雌Estrogen receptor (ER-1)/(mol·L濃Concentration/(mol·L -1)度稱icals名Chem分Groups類+--4 10---4 10---5 Atrazine10津拉特阿-----4 10-4 10-----4 10-4 10-----4 10-4 10 Atrazine-desethyl-desethyl eton津Terbum拉特 通阿 丁基 特丁 基二 乙去藥農類三嗪Triazines++---4 10-4 10-+---4 10-4 10 e ----4 10-4 etryn Prom凈Tricyclazole10草 唑撲 環三-----4 10-4 10+----4 10-4 10-----4 10-5 Paclobutrazol Myclobutanil10唑 唑效 菌多 腈藥唑Triazoles 農類 三---------4 10-6 10-4 10-5 10+--------4 10-6 10-4 10-5 10---------4 Tebuconazole10-5 Azoxystrobin10-5 10-4 10 Carbendazim醇ethyl酯Bensulfuron m靈唑菌隆菌戊嘧磺嘧 多芐磺Sulfonylureas 藥農類脲--+----4 10-6 10-4 10-------4 10-6 10-4 10+------4 Cycluron10-5 10-4 10 Ethirimol Metalaxyl隆 酚莠嘧靈環乙霜甲藥農他其Other pesticides---4 10---4 10---5。Nicosulfuron10應效強增光熒現出中試測應反抗拮隆 示磺嘧煙;“e”表應效種此出檢未示-”表-” indicates that the effect is not detected; “e” indicates the fluorescence enhancement effect in the antagonistic reaction test.:“注Note: “

生物學篩查(ER-CALUX)結果顯示,所有測試物均未表現出雌激素受體激動劑活性,不能排除某些農藥對雌激素的干擾不是通過受體激活途徑完成的,如阿特拉津。 據報道,阿特拉津的雌激素活性是通過抑制cAMP 特異性磷酸二酯酶-4 發揮作用,而不是通過激活或與經典ER 結合的途徑實現[28]。 測試結果顯示環莠隆具有雌激素拮抗活性,而撲草凈與E2 共暴露時熒光信號增強,但單獨暴露時熒光信號無明顯變化。 Wielogórska 等[13]在擬除蟲菊酯類殺蟲劑的雌激素受體拮抗劑測試中也發現熒光信號反應增強。 與ER-CALUX 測試結果相似,本研究中AR-CALUX 測試未篩查到雄激素激動劑活性物質。 多效唑、戊唑醇和三環唑3 種物質具有顯著的雄激素受體拮抗活性,且在試驗濃度下,這些化學物質對雄激素受體的拮抗效應呈現出劑量依賴性。

目前對農藥內分泌干擾的研究主要集中在雌激素和雄激素的作用上,而對其他非性激素功能的研究較少,如孕烷X 受體和GR 介導的活性。 本研究對糖皮質激素受體激動劑和拮抗劑進行了篩選,所測試農藥均未表現出GR 激動劑的活性,阿特拉津、撲草凈、三環唑和甲霜靈4 種物質檢測到弱糖皮質激素受體拮抗作用。 Zhang 等[23]采用CHO-K1 細胞hGRα的雙熒光素酶報告基因法證明了阿特拉津具有GR 拮抗作用,而去乙基阿特拉津和多菌靈對GR沒有活性,與本研究結果一致。

對水源水中篩查到的15 種農藥內分泌干擾效應的測試結果顯示,半數以上的測試物存在雌激素受體、雄激素受體或糖皮質激素受體拮抗效應。 環境中往往是多種內分泌干擾物并存條件下的綜合效應,未來研究應重點關注低劑量聯合暴露下的綜合效應以及農藥中間體和有毒代謝物的毒性效應,對生物體產生作用的機理研究等。 生物檢測技術以生物效應為目標導向,是內分泌干擾類農藥識別監測與風險評價的有效方法,但生物方法往往難以對目標物定量,因此應結合化學和儀器測試進行綜合性的科學評價,形成以生物檢測為導向、化學和儀器分析技術為支撐的內分泌干擾效應導向分析方法。

通訊作者簡介:賈瑞寶(1968—),男,博士,研究員,主要研究方向為供排水監測及飲用水安全保障技術。