脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對黃粉蟲毒性及其排泄行為

秦菲, 汪洋, 趙祎,, 陳明生, 范文佳, 郭寶元,*, 王松雪

1. 北京聯合大學生物化學工程學院,北京 100023

2. 國家糧食和物資儲備局科學研究院,北京 100037

3. 湖北以勒科技有限公司,武漢 430070

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),化學名為3α,7α,15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-8-酮,CASRN 為51481-10-8,又稱嘔吐毒素(vomitoxin),結構如圖1 所示,是禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)和黃色鐮刀菌(Fusarium culmorum)等真菌侵染谷物及其制品產生的有毒代謝產物[1-2]。DON 能引發人和禽畜拒食、嘔吐、生長延遲、生殖紊亂等癥狀,對人畜造成傷害[3]。 在我國,DON 在小麥和玉米中檢出陽性率和污染水平均較高[1-2],小麥和玉米中DON 的檢出率基本呈現由南向北逐漸增高之勢。 DON 污染水平一般在 0.3 ~ 1 mg·kg-1,部分甚至超過 5 mg·kg-1[1-2]。 為避免 DON通過飼料污染禽畜產品,糧食和飼料的DON 脫除非常重要。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的結構及其在生物體內的轉化過程注:DOM-1 表示脫環氧雪腐鐮刀菌烯醇;3-keto-DON 表示3-酮基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;3-epi-DON 表示3-異構化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。Fig.1 The deoxynivalenol (DON) structure and the metabolites in organismsNote: DOM-1 is de-epoxy-deoxynivalenol;3-keto-DON is 3-keto-deoxynivalenol;3-epi-DON is 3-epi-deoxynivalenol.

昆蟲是世界上最繁盛的動物類群之一[3-5]。 由于真菌毒素廣泛存在于各種糧食中,很多植食性昆蟲也不可避免地通過取食暴露于真菌毒素污染。 近年來,科學家發現昆蟲可以通過一系列的生理過程,將其攝入的真菌毒素代謝或排出體外[6-12]。 黃粉蟲(Tenebrio molitorlarvae)、黑水牤(Hermetia illucenslarvae)和黑菌蟲(Alphitobius diaperinusPanzer)等昆蟲能夠代謝50% ~80%攝入的玉米赤霉烯酮、黃曲霉素和 DON 等真菌毒素[6]。 van Broekhoven 等[7]發現部分DON 及3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-ADON)和15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-ADON)能夠被代謝和排出黃粉蟲體外,24 h 后蟲體內即檢測不到DON 殘留。 黃粉蟲對DON 的代謝率高達80% ~96%,同時,腸道中也檢測到DON 的環氧開環代謝產物脫環氧雪腐鐮刀菌烯醇(DOM-1)[6-12],由此可見黃粉蟲腸道微生物中存在著DON 降解菌。

黃粉蟲(Tenebrio molitor)是非常具有代表性的一種食用昆蟲品種,屬于鞘翅目(Coleoptera),擬步甲科(Tenebrionidae),粉甲屬(Lepidoptera)。 目前,DON在昆蟲體內代謝和毒理學研究鮮有報道。 本研究探究了DON 超標的飼料對黃粉蟲的影響,同時將考察DON 在黃粉蟲體內的代謝規律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和生物材料

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和13C 標記的DON穩定同位素標準溶液(100 mg·L-1)購自Romer 公司(美國)。 甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸和乙酸均為HPLC 級,購自默克公司(美國)。 實驗用水為Milli-Q 超純水。

實驗用黃粉蟲(Tenebrio molitorlarvae)購自北京本地花鳥魚菜市場。 在實驗室人工氣候箱中(25℃,濕度60%)馴化1 周后進行實驗。 馴養采用的飼料為小麥粉,由2020年黃淮海地區生產的小麥加工制成。

1.2 實驗儀器

四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀(Q-Exactive,賽默飛世爾科技公司,美國);快速液相色譜儀(UltiMate 3000,賽默飛世爾科技公司,美國)用于小麥 粉、 黃 粉 蟲 體 內 和 糞 便 中 DON、 3AcDON、15AcDON 及其代謝產物的分析。

液相色譜條件:Waters 公司CORTECSTM UPLC C18柱(100 mm×2.1 mm,1.6 μm),柱溫為 40 ℃,進樣量 2 μL。 流動相:A 為甲醇,B 為含 1%(體積分數)的甲酸和1 mmol·L-1乙酸銨的水溶液,流速0.3 mL·min-1。 梯度洗脫條件:0 ~2 min,90% B;2~3 min,90% ~80% B;3 ~4 min,80% ~79% B;4~5 min,79% ~74% B;5 ~7 min,74% B;7 ~7.5 min,74% ~40% B;7.5 ~10.5 min,40% B;10.5 ~13.5 min,40% B;13.5 ~14.5 min,40% ~5% B;14.5~17 min,5% B;17 ~18 min,5% ~90% B;18 ~21 min,90% B。

質譜條件:加熱電噴霧離子源(HEST)溫度為300 ℃;毛細管電壓為3.2 kV;離子傳輸管溫度為320 ℃。 Full scan/ddms2 掃描模式:采集范圍為200~800 Da,正離子采集;一級質譜分辨率為70 000 FWHM,二級質譜分辨率為17 500 FWHM,碰撞池能量(NCE)為35 eV。

1.3 DON 加標小麥粉飼料的制備

我國國家標準《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)[13]規定,谷物及谷物制品中DON 的限定量為1 mg·kg-1,需通過 UPLCMS/MS 技術對小麥粉原樣進行多毒素檢測。 為考察黃粉蟲對低(low dosage, LD)、中(medium dosage,MD)、高(high dosage, HD)3 種劑量 DON 污染的小麥粉飼料的耐受情況,需人工摻毒制備中濃度、高濃度污染的小麥粉飼料,相關方法如下:分別準確稱取0.815 mg 和1.63 mg DON 毒素標準品,加入2 mL水渦旋振蕩至完全溶解,分別將DON 水溶液與5.0 g 飼料混勻,然后再與10.0 g 飼料混勻,以此方式逐漸加入飼料混勻,最后將490 g 飼料全部混勻,分別制成5 mg·kg-1中劑量組和8 mg·kg-1高劑量組的摻毒飼料,未經人工添加DON 的小麥粉作為低劑量對照組。

混勻后采用四分法取樣,對人工摻毒飼料中DON 的濃度進行檢測,以評價摻毒的均一性。

1.4 DON 暴露實驗

馴養后的黃粉蟲禁食48 h,在溫度(25±1) ℃、濕度60%的條件下進行DON 暴露。 在250 mL 燒杯中放入30.0 g 黃粉蟲(約270 條),每3 d 投喂黃粉蟲質量10%的低、中、高3個濃度(分別定義為LD、MD、HD)的DON 染毒小麥粉,每組設置2個平行。實驗期間,每3 d 測定黃粉蟲體質量、收集糞便并稱量,剔除死亡黃粉蟲,記錄黃粉蟲及其糞便質量、死亡黃粉蟲的數量,暴露時間為14 d。 最后一次喂食后,在 0、1、2、4、8、12、24 和 48 h 分別取黃粉蟲 3.0 g,于-80 ℃保存。 將收集的黃粉蟲糞便在研缽中研磨成顆粒均勻的粉末置于-80 ℃冰箱中保存。

1.5 樣品前處理

小麥粉樣品:準確稱取小麥粉5.00 g 樣品,加入20 mL 乙腈-水-乙酸(體積比為 70 ∶29 ∶1)提取液,用渦旋混合器混勻1 min,置于渦旋振蕩器上提取20 min,然后以 7 000 r·min-1離心 5 min,準確移取0.5 mL 上清液加入0.5 mL 去離子水,渦旋混勻,然后用冷凍離心機以 4 ℃、12 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,過 0.2 μm 有機濾膜,取 180 μL 過濾液加入20 μL 內標液,混勻上機。

黃粉蟲樣品:將黃粉蟲在50 ℃烘箱中烘干至恒重,在研缽中研磨成顆粒均勻的粉末。 稱取0.5000 g 加入乙腈-水-乙酸(體積比為 70 ∶29 ∶1)提取液 2 mL。 并用渦旋混合器混勻,置于渦旋振蕩器上提取20 min,置于超聲機中超聲15 min;然后以12 000 r·min-1離心10 min,準確移取0.5 mL 上清液和0.5 mL 去離子水,渦旋混勻,然后用冷凍離心機以4℃、12 000 r·min-1離心20 min,用針頭取下層液體,用0.2 μm 有機濾膜過濾,取180 μL 過濾液加入20 μL 內標液,混勻上機。

黃粉蟲糞便:稱取0.5000 g 加入乙腈-水-乙酸(體積比為 70 ∶29 ∶1)提取液 2 mL。 用渦旋混合器混勻1 min,置于渦旋振蕩器上提取20 min,然后以7 000 r·min-1離心5 min,精確移取0.5 mL 上清液加入0.5 mL 去離子水,渦旋混勻,然后用冷凍離心機以 4 ℃、12 000 r·min-1離心 10 min,取上清液過 0.2 μm 有機濾膜,取 180 μL 過濾液加入 20 μL 內標液,混勻上機。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 小麥粉中的DON

實際環境中,黃粉蟲接觸DON 途徑主要是膳食暴露。 本研究以DON 染毒小麥粉作為黃粉蟲飼料,分析黃粉蟲攝入染毒小麥粉后,DON 在黃粉蟲體內和排泄物中的DON 殘留和代謝產物。 將黃淮海地區2020年生產的小麥制粉,測得其DON 殘留為0.25 mg·kg-1,低于食品安全標準GB 2761—2017中DON 的限量1 mg·kg-1。 以該小麥粉作為暴露的對照組,定義為LD 組,再通過向此小麥粉中加入DON 標準物質溶液,以制備DON 污染水平比較高的飼料。 通過液相色譜質譜檢測,獲得2個不同DON 污染水平的小麥粉飼料樣品,分別為5.51 mg·kg-1(MD)和8.83 mg·kg-1(HD)。 后續黃粉蟲的 DON暴露將以此3個樣品為飼料。

2.2 黃粉蟲的DON 暴露

以LD、MD 和 HD 3 組不同 DON 濃度的小麥粉為飼料飼喂黃粉蟲,經過3 d 的喂食,觀測到染毒小麥粉已全部轉化為黃粉蟲糞便。 在此期間,黃粉蟲將全部染毒飼料嚙食干凈,并未有剩余的小麥飼料,說明黃粉蟲并未對染毒小麥粉有厭食的情況。

對黃粉蟲進行14 d 的暴露實驗,觀測黃粉蟲的體質量變化和死亡情況,由表1 可知,LD 組幼蟲存活率(85%)＞HD 組幼蟲存活率(83%)＞MD 組幼蟲存活率(78%)。t檢驗結果表明不同劑量組之間存活率無顯著差異(P＞0.05)。 黃粉蟲進食高濃度 DON污染的小麥粉并不影響其存活率,通過外推法粗略估計DON 對黃粉蟲的半數致死濃度(LC50)＞5 000 mg·kg-1,表明DON 對黃粉蟲為低毒或無毒。

表1 DON 暴露對黃粉蟲生長的影響Table 1 Effect of DON on the development of Tenebrio molitor L.

經過14 d 暴露實驗,LD 組黃粉蟲體質量增加4.97 mg;MD 量組體質量增加1.28 mg;HD 組體質量增加5.37 mg。 通過t檢驗表明3個實驗組中黃粉蟲的增重并無顯著性差異(P＞0.05=0.407)。 黃粉蟲在喂養第5 天時,各組均出現了化蛹的情況,通過t檢驗表明3個實驗組的化蛹情況,同樣無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 黃粉蟲體內DON 殘留

在不同的時間點對染毒后的黃粉蟲取樣,檢測其體內DON 濃度。 如圖2(a)所示,DON 濃度整體為下降趨勢,黃粉蟲在進食含DON 的小麥粉前2 h體內毒素呈現上升趨勢,2 h 時DON 濃度在體內達到最高值,之后明顯下降;在8 h 后DON 開始緩慢下降;24 h 時毒素完全降解。 隨著黃粉蟲開始取食,其體內的DON 逐漸上升。 黃粉蟲體內酶和腸道微生物參與DON 的代謝過程[10]。 DON 在黃粉蟲體內的消除過程還包括其排便過程。 在MD 和HD 組中,2 h 后黃粉蟲體內的DON 濃度達到峰值,而在LD 組中,DON 達到峰值需要的時間則會比較晚(8 h)。 這說明高濃度的DON 更容易激活黃粉蟲體內的代謝通路和腸道微生物對DON 的代謝活性。 在MD 和HD 組中,DON 濃度在黃粉蟲體內會出現一個平臺,說明DON 的攝入和代謝形成了一個平衡態。 隨后,隨著DON 污染的飼料經排泄排出體外和代謝水平升高,黃粉蟲體內DON 濃度會明顯下降,在24 h 后黃粉蟲體內沒有DON 毒素殘留。

圖2 黃粉蟲體內DON 濃度變化注:(a)DON 在黃粉蟲體內濃度;(b)DON 在黃粉蟲體內的生物累積因子。Fig.2 The DON concentration in Tenebrio molitor L.Note: (a) DON concentration in Tenebrio molitor L.; (b) Bioconcentration factors of DON in Tenebrio molitor L..

生物累積因子(bioaccumulation factor, BAF)反映了污染物在動物體內累積效應。

式中:Cfeed是飼料中的DON 濃度,CTM為黃粉蟲體內的DON 濃度。

當BAF＞1 表示污染物在生物體內有生物累積作用,BAF＜1 表示無生物累積作用。 生物累積因子用黃粉蟲體內DON 的濃度與飼料中DON 的比值來表示(式1)。 黃粉蟲體內的生物累積因子變化趨勢見圖2(b),結果表明DON 進入黃粉蟲體內,容易通過代謝和排泄排出體外,無生物累積效應。

2.4 DON 在黃粉蟲體內的排泄

采用排泄率(excretion rate, ER)來表征通過糞便排出的DON,采用代謝率(metabolization rate, MR)來表征DON 在黃粉蟲體內通過體內酶和腸道微生物代謝的比例。

式中:Mfeed為投喂飼料的總量,Cfeed為飼料中DON的濃度,Mfeces為產生糞便的總量,Cfeces為糞便中DON 的濃度。

黃粉蟲糞便中DON 的檢測結果如表2 所示,在糞便樣品中均未檢測到DON 衍生物。 進食污染飼料的黃粉蟲糞便中的DON 濃度低于污染小麥粉飼料 DON 的濃度。 LD 組黃粉蟲糞便中未檢出DON。 MD 組的糞便的 DON 濃度為 0.16 mg·kg-1,DON 排泄率為9%;HD 組糞便 DON 濃度為0.47 mg·kg-1,DON 排泄率為 17%。 由此可以推斷,DON 在黃粉蟲體內的轉化途徑,主要是降解。 黃粉蟲進食DON 污染的小麥粉飼料后,小部分通過糞便代謝排出,24 h 后體內沒有DON 殘留,說明大部分DON 在黃粉蟲體內通過腸道微生物和體內酶降解。

表2 黃粉蟲糞便中DON 濃度Table 2 DON in feces of Tenebrio molitor L. (mg·kg-1)