對羥基苯甲酸丙酯對大型溞(Daphnia magna)的毒性作用及其分子機制

李鈺靜, 黎昕, 馬雲, 李曉怡, 曾鴻鵠,2,3, 梁延鵬,2,3, 宋曉紅,2,3,*

1. 廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室,桂林理工大學,桂林 541000

2. 巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心,桂林理工大學,桂林 541000

3. 廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室科教結合科技創新基地,桂林 541000

對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben, PrP)是一種廣泛應用于個人護理品和藥物的抗菌防腐劑。 由于該類防腐劑的廣泛使用,在不同環境介質(如土壤、水體和室內灰塵等)中均被檢出[1]。 PrP 是地表水體中該類防腐劑檢出濃度和檢出率最高的物質之一[2-3]。 例如,中國珠江地區地表水中檢測到PrP 的最大濃度為3 142 ng·L-1[3],日本德島和大阪的城市溪流中檢測的PrP 最大濃度為207 ng·L-1[4],西班牙加利西亞地區檢測的PrP 最大濃度為69 ng·L-1[5]。在污水受納水體中,其濃度可能更高[6],并可能影響水生生物的正常生理過程[7]。 也有研究表明,對羥基苯甲酸酯類及其鹽類能在水體和人體組織細胞中積累[8]。 PrP 的結構與雌激素相似,并具有外源性雌激素作用[9],屬于內分泌干擾物(EDCs)[10]。 Pedersen等[11]在虹鱒(Oncorhynchus mykiss)腹腔中注射的對羥基苯甲酸乙酯(EtP)、對羥基苯甲酸丁酯(BuP)和PrP 可引起雌激素反應,顯著誘導魚體內卵黃原蛋白(VTG)的增加,表明 BuP 和 PrP 具有與雙酚 A(BPA)類似的雌激素作用。 董力等[12]發現PrP 對人體角質形成細胞(HaCat)具有細胞毒性作用,可抑制細胞增殖,且具有時間-劑量效應。 PrP 長時間持續存在于水環境中,對水生生物的潛在風險不可忽視。

溞類是水體中初級生產者(藻類)和消費者(如魚類)之間的連接樞紐,可影響食物網中營養物質和能量的流動,在水生生態系統中發揮重要作用[13]。 大型溞(Daphnia magna)具有繁殖快、生長周期短等優點,對毒性物質反應靈敏,是一種重要的生態指示種。 Chatterjee 等[14]發現將多代大型溞暴露于受糞大腸桿菌污染的野外溪流水中,會影響大型溞正常的生長發育,出現體表面積增大、血紅蛋白和產卵數量增加等異常性狀,基于F0 和F1 代樣品蛋白組學的分析發現,污染物改變了大型溞的能量代謝途徑,機體出現了氧化應激和氧轉運減弱。

許多環境污染物可改變解毒和抗氧化相關基因的表達[15],如過氧化氫酶(cat)、谷胱甘肽轉移酶(gst)和激素受體96(hr96)等,從而引起暴露生物的生理變化。cat、gst和hr96是大型溞解毒相關的基因,CAT 將H2O2分解成O2和 H2O,以減輕 H2O2對細胞的氧化損傷[16]。 GST 是調節細胞對有毒化學物質反應的分子保護機制中的一種清除劑[17]。hr96是一種混雜的核受體,由許多內源和外源物質激活[18],負責調節許多參與解毒過程的基因。cyp314、vtg是與大型溞生長發育相關的基因,cyp314屬于線粒體細胞色素P450亞家族的基因,參與蛻皮酮的生物合成,調節無脊椎動物的生長和繁殖過程[19]。vtg是卵黃蛋白的前體,是許多卵生動物體內的主要脂蛋白[20],受雌激素控制[21]。 因此,可選用cat、gst、hr96、cyp314和vtg等基因,研究生物體的生存、生長速率和繁殖等生理反應與分子水平變化的密切關系[22]。

本研究以大型溞的表型變化(體長、殼刺長、復眼面積、體表面積和心跳等)作為毒性效應指標,使用熒光定量 PCR 技術檢測大型溞cat、gst、hr96、cyp314和vtg等基因mRNA 的相對表達量變化,研究PrP 對大型溞抗氧化和解毒代謝系統及生長發育相關基因轉錄表達的影響,為合理的評價PrP 的潛在毒性提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗生物

大型溞(Daphnia magna)購買于江門弘光高科技有限公司。 試驗開始前,大型溞在實驗室馴養2 周,實驗用水為曝氣72 h 的自來水;溫度(20±2) ℃;pH 7.0±0.1、溶解氧＞5 mg·L-1、光暗期為 12 h ∶12 h;光照強度為8 000 lx。 大型溞每3 d 換水、喂食純種斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)。 斜生柵藻購于中國科學院武漢水生生物研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性毒性與亞慢性毒性暴露實驗

根據文獻[23]的實驗方法,對大型溞幼溞進行急性毒性與亞慢性毒性暴露實驗,探究PrP 對大型溞生長發育的影響。 選取出生約24 h 的480 只健康幼溞進行暴露試驗,以PrP 的水環境檢測濃度(3 142 ng·L-1)[3]、大型溞 24 h-LC50(21.1 mg·L-1)[24-26]和 24 h最大無觀測效應濃度(NOEC 24 hfeeding≥4 mg·L-1[26])為參考依據,針對日常水環境、特殊環境水體(如污水受納水體、污水進水口等)以及PrP 在水環境蓄積的極端情況等不同情形,分別設計了0、0.3、12 和 480 μg·L-14個不同的處理組。 將 PrP(分析純,西隴科學有限公司)用DMSO(分析純,西隴科學有限公司)配制成儲備液(20 g·L-1),并逐級稀釋配制成不同濃度的暴露液,暴露液中DMSO 的濃度為0.005% (V∶V)。 每個處理組設置 4 組平行,每個平行組中用100 mL 的玻璃皿裝入50 mL 暴露液,隨機放入15 只幼溞,置于恒溫光照培養箱中,其他條件與馴養期間相同。 暴露實驗分為4 d 和8 d 共2 組,每日記錄大型溞的存活情況。

1.2.2 大型溞表型變化的測定與取樣

4 d 和8 d PrP 暴露實驗結束后,使用體式顯微鏡(Revolve,美國ECHO)觀察和記錄大型溞的表型變化。 將存活的大型溞置于顯微鏡下觀察,統計大型溞30 s 的心跳次數[27],用目鏡測微尺測量大型溞的體長、體高和殼刺長,用顯微鏡自帶軟件測量復眼、心臟和體表面積。 觀察結束后,將大型溞置于RNA 保存液中(Takara),-20 ℃保存備用,用于提取總RNA。

1.2.3 總RNA 提取和cDNA 合成

采用RNAiso Plus 試劑(TaKaRa)提取大型溞的總RNA。 取8 只大型溞作為混合樣品,用勻漿儀(XFSTPRP-48,上海凈信實業發展有限公司)進行冷凍勻漿,經過均質化—相分離—RNA 沉淀—RNA洗滌—RNA 溶解等過程,得到大型溞的總RNA。使用微量分光光度計(Q5000,美國 Quawell)檢測RNA 的質量。 用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒(TaKaRa)將RNA 反轉錄為cDNA,用于熒光定量PCR 實驗。

1.2.4 熒光定量PCR 實驗

根據文獻[28]的方法,設計qPCR 特異性引物(表1),引物由華大基因公司合成。 以各處理組和對照組的32個樣品 cDNA 為模板,以大型溞β-actin基因作為內參基因,參照PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 試劑盒(ABI,美國賽默飛世爾科技公司)的操作說明,使用qPCR 儀(QuantStudio 3,美國賽默飛世爾科技公司)開展實時熒光定量PCR 實驗,每個樣品重復3 次,并設置陰性對照。 PCR 反應體系為:PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL,cDNA 模板 2 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL,雙蒸水6 μL。 反應程序為預變性:95 ℃,30 s。 40個循環:95 ℃,5 s;55 ℃,30 s。 熔解曲線:95 ℃,10 s;65 ℃,5 s;95 ℃、0.5 s。 反應結束后,查看 PCR 的擴增曲線和熔解曲線判斷PCR 反應的特異性。

表1 大型溞熒光定量PCR 實驗的特異性引物序列Table 1 Specific primer sequences of Daphnia magna used in the qPCR experiments

1.3 數據統計與分析

實驗結果采用平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示,用Graphpad 軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)、Tukey 多重比較,不同 PrP 處理組與空白對照組之間開展配對t檢驗,以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 PrP 對大型溞生長發育的影響

實驗結束后,對照組大型溞生長正常,無死亡;PrP 暴露的各處理組中,480 μg·L-1處理組暴露4 d的死亡率為1.67%;12 μg·L-1處理組暴露8 d 的死亡率為3.33%;其余各組大型溞存活率均為100%。不同濃度PrP 暴露后,與對照組的表型相比,處理組出現了殼刺長度減小,體高、體長、心臟面積和體表面積增加的發育異常現象(圖1)。 大型溞發育異常的表型統計結果如圖2 和圖3 所示。

圖1 對羥基苯甲酸丙酯(PrP)暴露后大型溞的生長發育異常注:(a)4 d 對照組的大型溞,(b)4 d 處理組的大型溞,(c)8 d 對照組的大型溞,(d)8 d 處理組的大型溞;A 標示殼刺長度減小,B 標示體高增加,C 標示體長增加,D 標示心臟面積增加。Fig.1 Abnormal development of Daphnia magna after propylparaben (PrP) exposureNote: (a) Daphnia magna in the control group of 4 d, (b) Daphnia magna in the treatment group of 4 d, (c) Daphnia magna in the control group of 8 d, (d) Daphnia magna in the treatment group of 8 d; A shows shortening of the shell spines length,B shows increase of the body height, C shows increase of the body length, and D shows increase of the heart area.

由圖2(a)可知,不同濃度PrP 暴露4 d 后,各處理組大型溞的體長與對照組無顯著性差異(P＞0.05);暴露8 d 時,12 μg·L-1處理組大型溞的體長顯著大于對照組(1.11 倍)(P＜0.05)。 在圖 2(b)中,480 μg·L-1PrP 暴露4 d 時,大型溞體高顯著大于對照組(P＜0.05);暴露8 d 后,PrP 各處理組大型溞的體高均大于對照組,其中12 μg·L-1和 480 μg·L-1PrP 處理組的體高顯著增加(P＜0.05)。 由圖2(c)可知,不同濃度PrP 暴露 4 d 時,480 μg·L-1處理組中大型溞殼刺長度平均值僅為對照組均值的0.86 倍,顯著小于其他組(P＜0.05);暴露 8 d 后,12 μg·L-1處理組的大型溞殼刺長度平均值為對照組均值的1.15 倍,顯著大于其他組(P＜0.05)。

在圖2(d)中,PrP 暴露4 d 后,各組間大型溞復眼面積并無顯著差異(P＞0.05);暴露 8 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組大型溞復眼面積顯著增加(P＜0.05)。由圖2(e)可知,PrP 暴露4 d 后,480 μg·L-1處理組大型溞的體表面積顯著大于對照組(P＜0.05);暴露8 d后,各處理組中大型溞的體表面積均顯著大于對照組(P＜0.05);其中,12 μg·L-1處理組變化最顯著,該組平均值為對照組均值的1.35 倍。

圖2 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 后大型溞表型的變化注:柱形圖上的不同字母代表相同處理時間點不同PrP 處理組間的顯著差異(P＜0.05);n=30,下同。Fig.2 Changes of phenotypes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 dNote: Different letters on the bars represent significant differences between the PrP treatment groups after the same exposure times (P＜0.05); n=30, the same as follows.

相比暴露4 d,PrP 暴露8 d 后大型溞的體長、體高、復眼面積和體表面積均顯著增長;統計數據表明大型溞的發育異常主要表現為:暴露4 d 后,480 μg·L-1PrP 處理組體高、體長變化顯著;暴露8 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組表型變化最顯著,表現為促進大型溞的生長發育。

由圖 3(a)可知,PrP 暴露 4 d 和 8 d 后,各處理組心率變化顯著(P＜0.05),其中480 μg·L-1處理組心率最高,刺激反應顯著(P＜0.05)。 而隨暴露時間延長,0.3 μg·L-1處理組暴露8 d 時的心率較暴露4 d 時顯著降低(P＜0.05)。 在圖 3(b)中,PrP 暴露 4 d 后,480 μg·L-1處理組心臟面積顯著大于對照組(P＜0.05);暴露8 d 后,12 μg·L-1處理組心臟面積平均值為對照組的均值1.33 倍,增長程度顯著高于其他處理組(P＜0.05)。 相比暴露 4 d,PrP 暴露 8 d 時大型溞的心臟面積顯著增長(P＜0.05);綜上可知,大型溞暴露于不同濃度的PrP 4 d 和8 d 后,心臟面積和心率均受到影響,表明PrP 對大型溞具有心臟毒性。

圖3 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對大型溞心臟的影響注:柱形圖上的不同字母代表相同處理時間點不同PrP 處理組間的顯著差異(P＜0.05),*代表相同劑量PrP 暴露不同時間后的顯著差異(P＜0.05);n=30,下同。Fig.3 Effects on Daphnia magna hearts in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 dNote: Different letters on the bars represent significant differences between the PrP treatment groups after the same exposure times (P＜0.05), and stars (*) on the bars represent significant differences after different times between the same PrP treatment groups (P＜0.05); n=30, the same as follows.

2.2 PrP 對大型溞解毒和生長發育相關基因表達的影響

在不同濃度的PrP 暴露條件下,cat基因的mRNA 表達量變化趨勢如圖4(a)所示,暴露4 d 后,0.3 μg·L-1和 12 μg·L-1處理組cat基因的表達量顯著上調(P＜0.05),480 μg·L-1處理組顯著下調(P＜0.05);暴露8 d 時,PrP 各處理組均與對照組無顯著差異(P＞0.05),但 0.3 μg·L-1處理組顯著小于 12 μg·L-1處理組(P＜0.05)。 圖 4(b)中,暴露 4 d 后,12 μg·L-1PrP 處理組gst基因的相對表達量顯著下調(P＜0.05);暴露8 d 時,PrP 各處理組均與對照組無顯著差異(P＞0.05)。 圖 4(c)展示hr96基因的 mRNA 表達量的變化趨勢,暴露 4 d 時,0.3 μg·L-1PrP 處理組hr96基因的表達量顯著上調(P＜0.05),480 μg·L-1PrP 處理組顯著下調(P＜0.05);暴露 8 d 后,PrP 各處理組hr96基因的表達量均無顯著變化(P＜0.05);但0.3 μg·L-1PrP 暴露 4 d 后hr96基因的表達量顯著大于8 d 處理組(P＜0.05)。 綜上可知,暴露4 d 時,大型溞的解毒相關基因具有一定的劑量效應;暴露時間延長至8 d 時,各處理組解毒相關基因與對照組無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對大型溞解毒相關基因表達的影響Fig.4 Effects on detoxification-related genes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 d

由圖 5(a)可知,0.3 μg·L-1PrP 處理組cyp314基因的mRNA 表達量先顯著上調(4 d,P＜0.05)后又顯著下降(8 d,P＜0.05)。 圖 5(b)中,480 μg·L-1PrP處理組暴露4 d 后vtg基因的表達量顯著下調(P＜0.05);暴露8 d 后,PrP 各處理組vtg基因的表達量均顯著下調(P＜0.05)。 由圖 4 和圖 5 可知,暴露4 d后,cyp314、vtg基因表達量的變化與解毒相關基因的變化基本保持同步;暴露 8 d 后,cat、gst、hr96和cyp314等基因無顯著變化,但PrP 各處理組vtg基因的表達量受到顯著抑制。

圖5 不同PrP 處理組暴露4 d 和8 d 對大型溞生長發育相關基因表達的影響Fig.5 Effects on growth and development genes of Daphnia magna in the different PrP treatment groups after exposure for 4 d and 8 d

3 討論(Discussion)

3.1 PrP 暴露對大型溞生長發育的影響

大型溞的自然增長率比生殖參數更加敏感,大型溞被低濃度污染物刺激后,受到輕度逆境脅迫,可促使其瞬時增長率增大,以此來抵御外部不良的環境條件[31]。 本研究中,12 μg·L-1PrP 處理組大型溞的體長、體高、殼刺長、復眼面積和體表面積均顯著大于對照組,表明PrP 促進了大型溞的生長發育。這與一些研究結果相似,黃國蘭等[32]研究發現1.0、2.0 和4.0 mg·L-1的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對大型溞繁殖有抑制作用,而0.5 mg·L-1的DBP 顯著提高了大型溞的凈生殖率;劉青等[31]發現低濃度組(0.432、0.768 和1.120 μg·L-1)印楝素暴露大型溞后,內稟增長率與對照組相比也略有提高。 這些結果表明,大型溞種群動態受到了影響,這種刺激作用干擾了大型溞正常的生長發育,可能會造成大型溞的生命周期紊亂或產生致肥效應。

卵黃素的產生受雌激素的控制,所以常被用作雌激素化合物的生物標志物[33-34]。 暴露4 d 后12 μg·L-1PrP 處理組vtg基因的表達量不穩定,可能與大型溞的個體差異有關;暴露4 d 后,cyp314、vtg基因的表達量隨著PrP 濃度的升高先增加后下降,呈拋物線型劑量-效應關系;低濃度 PrP 可刺激cyp314、vtg的表達,具有雌激素效應,但高濃度的PrP 暴露可能對大型溞具有毒害作用,表現為毒性效應,造成大型溞的組織細胞損傷和表型變化。 由此說明,PrP 對大型溞蛻皮激素與卵黃蛋白的合成造成影響,并誘導了大型溞的生長發育異常。

此外,大型溞的生長發育過程中,表型變化相對于基因表達具有一定的滯后性,PrP 暴露4 d 的條件下基因的變化可能造成暴露8 d 時大型溞的發育異常。 Jemec 等[35]研究發現,13.8 mg·L-1(亞致死濃度)BPA 暴露21 d 后,大型溞體長和平均產卵量降低,并顯著抑制了CAT 和GST 的酶活性。 本研究中,PrP 暴露8 d 時,各處理組vtg基因的mRNA 表達量均受到抑制,可能與大型溞體內的活性氧積累引起的抗氧化與解毒反應的能量消耗有關,從而抑制了大型溞卵黃蛋白的產生,使大型溞的發育受到影響。Wang 等[17]發現布洛芬(IBU)暴露后大型溞也出現了類似的現象,IBU 的存在引發的解毒過程也可能消耗大量的能量,導致機體生長和產卵所需的能量減少,產卵量減少,從而導致生殖能力下降。

3.2 PrP 暴露對大型溞的心臟毒性

大型溞心臟器官與其他節肢動物不同,是肌源性的,由一層肌肉細胞組成,在生理水平上可響應各種內源性信號分子,如生物體內產生和循環的激素和神經遞質[27]。 心率是反映污染物對大型溞血液循環系統影響的敏感生理指標[36]。 研究發現,PrP 可與血漿蛋白結合,導致運輸激素的外周活動紊亂[37]。本研究中,480 μg·L-1PrP 暴露 4 d 后,大型溞心率激增且心臟面積顯著增加,cat基因的相對表達量顯著下調,表明PrP 對心臟具有顯著的毒性作用。 也可能是由于PrP 在短時間、高濃度的刺激下,大型溞發生了氧化應激反應,擾亂了大型溞的正常生理功能。

生物在轉錄水平上的變化,尤其是暴露于環境污染物時解毒系統所涉及的基因表達變化可提供最早期的警告信號[36]。 PrP 暴露 4 d 后,0.3 μg·L-1和12 μg·L-1處理組大型溞解毒相關基因相對表達量顯著上調,生物體通過調節cat、gst活性來清除活性氧以避免氧化損傷;而大型溞在480 μg·L-1處理組的重度脅迫下,cat活性降低,過度積累活性氧(ROS)會導致有機體損傷。 Silva 等[38]的研究表明,對羥苯甲酸酯類物質的暴露導致了尼羅羅非魚鰓和肝細胞的生化變化,調節魚鰓和肝臟的抗氧化劑活性顯著增加;Wang 等[39]的研究表明,暴露于啶酰菌胺會降低斑馬魚胚胎的超氧化物歧化酶(SOD)活性,增加CAT 活性,并誘導氧化應激;Cui 等[40]研究發現,在急性接觸氯蟲苯甲酰胺、氰蟲苯甲酰胺和氟苯甲酰胺等農藥后,大型溞體內也觀察到類似的抗氧化酶活性變化。 本實驗中,暴露 4 d 后,cat、hr96基因的表達量隨著濃度升高呈現先升高后下降的趨勢,具有拋物線型劑量-效應關系。 大型溞暴露于PrP 的整個周期中,cat、hr96的表達量變化基本保持同步,其同步的原因可能是PrP 脅迫大型溞時cat、hr96協同調節生長發育。 然而,由于調控機制的復雜性,后期需要研究更多參與抗氧化解毒系統的基因的變化,如nrf2、nqo1和gpx等[29]。

通過研究PrP 對大型溞生理變化(如體長、殼刺長、體表面積和心跳等)的影響,分析所選的5個基因(cat、gst、hr96、cyp314、vtg)的表達量來評估 PrP 對大型溞的毒性作用及分子機制。 PrP 暴露對大型溞的生長發育具有促進作用,呈現一定的時間與劑量效應,且PrP 暴露對大型溞具有一定的心臟毒性效應。 暴露4 d 時,大型溞解毒相關基因(cat、gst和hr96)與生長發育相關基因(cyp314、vtg)的表達量的變化基本保持同步,并呈現一定的劑量效應,表明這5個基因協同調節大型溞的解毒過程與生長發育過程。 綜上所述,PrP 能影響大型溞正常的生長發育,研究結果可為PrP 的環境風險表征提供生態毒理數據。