壬基酚對(duì)斑馬魚不同組織中抗氧化酶活力的影響

張銀杰, 張洪昌, 凌思源, 蔣玲玲, 彭程, 張衛(wèi),*

1. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)化工過程環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,上海 200237

2. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)新型污染物環(huán)境健康影響評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海市環(huán)境科學(xué)研究院,上海 200233

壬基酚(nonylphenol, NP)作為一種典型的酚類內(nèi)分泌干擾物,是重要的精細(xì)化工原料和中間體。水環(huán)境中的NP 主要來自于非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚,其伴隨工業(yè)和城鎮(zhèn)污水處理后的出水和污泥進(jìn)入環(huán)境并繼續(xù)降解成危害性更強(qiáng)的NP[1]。 研究表明,NP 具有較強(qiáng)的疏水性,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在水中的半衰期可長(zhǎng)達(dá)1 ~2個(gè)月,并會(huì)在沉積物中吸附積累,即使水體不再受納NP 時(shí)也可以持續(xù)不斷地釋放到水中[1-2]。 NP 對(duì)水生動(dòng)物的毒害影響包括生殖、免疫、內(nèi)分泌及神經(jīng)系統(tǒng)等[3-6],主要毒害方式除了在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)誘導(dǎo)氧化損傷外,還可以通過模擬內(nèi)源性雌激素與相關(guān)受體結(jié)合,干擾動(dòng)物體內(nèi)的激素分泌、基因表達(dá)和信號(hào)傳遞等[7-8]。 更為重要的是,NP 可以在水生動(dòng)物體內(nèi)富集或經(jīng)食物鏈放大,對(duì)水生動(dòng)物和人類具有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[9]。

水生環(huán)境中的NP 濃度往往是變化的,例如污水的集中排放,降雨導(dǎo)致的底泥攪動(dòng)再釋放,或稀釋作用、自然降解等均可能導(dǎo)致NP 濃度的增大或減小[10-11],繼而引起生物體內(nèi)的濃度變化。 此前的研究表明,NP 在水生動(dòng)物體內(nèi)的積累清除過程一般符合兩箱一階動(dòng)力學(xué)模型,體內(nèi)NP 的濃度會(huì)隨著暴露時(shí)間和濃度增加而增加,直至與水體平衡[12-13]。水生動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化、解毒酶能夠抵抗外源性污染物生成的ROS 及其本身或代謝物的毒性,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)能有效清除機(jī)體內(nèi)的ROS;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)能夠催化多類親電底物與還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)結(jié)合以抵抗毒性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損害[14-15]。 這些抗氧化酶和調(diào)節(jié)物質(zhì)的波動(dòng)往往作為機(jī)體氧化應(yīng)激的生物敏感指標(biāo),用于監(jiān)測(cè)污染物對(duì)生物的毒害效應(yīng)[16],同時(shí)也可以作為污染物濃度變化的指示劑。 值得注意的是,由于水生動(dòng)物不同組織承擔(dān)著各自的功能,其對(duì)于外源污染物的敏感性也不盡相同。 例如,貽貝的鰓組織對(duì)于外源污染物脅迫的敏感性總是高于消化腺,原因在于鰓部是吸收水體污染物的直接器官,而消化腺因?yàn)槌袚?dān)重要的代謝功能而需要較高的承受閾值[17]。

目前,關(guān)于NP 對(duì)水生動(dòng)物的毒性研究并不少見,但往往側(cè)重于觀察不同濃度水平下急性或慢性暴露后的直接變化,關(guān)于NP 對(duì)魚體內(nèi)抗氧化酶的動(dòng)態(tài)影響研究比較有限,缺乏對(duì)魚體NP 濃度變化與毒性效應(yīng)之間聯(lián)系的認(rèn)識(shí)。 本文以斑馬魚為供試生物,通過考察NP 在暴露和凈化過程中對(duì)不同組織(頭部、肌肉和內(nèi)臟團(tuán))中抗氧化酶(SOD、CAT、GST 和GSH)活力影響的變化,進(jìn)一步探究NP 對(duì)魚類的毒性效應(yīng)和作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)生物

受試成年斑馬魚(Danio rerio)購(gòu)自上海某熱帶魚市場(chǎng),均為同期受精卵孵化而成,年齡相近,平均體長(zhǎng)為2 ~3 cm。 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后挑選健康且體型接近的個(gè)體繼續(xù)馴養(yǎng)2 周以上。 實(shí)驗(yàn)用水采用曝氣48 h 的自來水,以孵化后的豐年蟲卵(天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司)喂食,光照維持每天12 ~14 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

急性毒性實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)實(shí)驗(yàn)法,每隔24 h 更換實(shí)驗(yàn)溶液。 設(shè)置溶劑對(duì)照組以及一系列濃度的NP 處理組,NP(異構(gòu)體混合物,純度＞98%,Adamasbeta)的質(zhì)量濃度設(shè)為 59.6、95.4、152、250、390、625、790 和 1 000 μg·L-1,乙醇助溶劑濃度為 0.1 mL·L-1。 每組投放15 尾斑馬魚,馴養(yǎng)期間充分飼喂,直至實(shí)驗(yàn)前24 h 停止喂食。 96 h 內(nèi)觀察并記錄斑馬魚的癥狀及死亡情況,觸碰尾部無反應(yīng)即視為死亡,并及時(shí)移除。

酶活影響實(shí)驗(yàn)根據(jù)急性毒性結(jié)果設(shè)置3個(gè)濃度的 NP 處理組,質(zhì)量濃度分別為 5、50 和 100 μg·L-1,同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組,每個(gè)濃度水平設(shè)置3個(gè)平行。 實(shí)驗(yàn)設(shè)置為14 d 暴露期和7 d 凈化期,每隔48 h 更換實(shí)驗(yàn)溶液。 暴露14 d 后各自轉(zhuǎn)入潔凈的實(shí)驗(yàn)用水,每天更換一半。 投喂飼料后將殘?jiān)图S便用虹吸法吸出。 實(shí)驗(yàn)用水水質(zhì)滿足斑馬魚的生存需求,水溫維持在(22±1) ℃。 以斑馬魚投入暴露溶液的時(shí)間為 0 d 計(jì),于 1、7 和 14 d (暴露階段)以及15 d、21 d (凈化階段)取樣。

1.2.2 SOD、CAT、GST 活力和 TP、GSH 含量的測(cè)定

斑馬魚樣品在冰上麻醉后用蒸餾水沖洗,并用濾紙吸干水分,每個(gè)平行樣取3 尾合并處理。 用預(yù)冷的解剖刀等小心分離魚頭、魚身和內(nèi)臟團(tuán),魚身剔除主骨,內(nèi)臟團(tuán)除去魚子。 稱得各組織質(zhì)量,以1 ∶4(m∶V)的比例加入4 ℃的生理鹽水,冰水浴中勻漿處理后于 4 ℃、4 000 r·min-1離心 15 min,上清液用生理鹽水稀釋成各自的最佳濃度。

SOD、CAT、GST 活力和 GSH、總蛋白(total protein, TP)含量測(cè)定嚴(yán)格按照測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所)說明書的方法進(jìn)行;光密度(optical density, OD)用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用冦氏法用EXCEL 2019 計(jì)算NP 對(duì)斑馬魚的LC50和95%置信區(qū)間,具體計(jì)算方法參照李翠萍等[18]的冦氏法。 酶活實(shí)驗(yàn)最后結(jié)果均表示為與溶劑對(duì)照組水平(100%)的比值,即相對(duì)活力(%)或相對(duì)含量(%),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示,測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 (IBM, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各NP 處理組與對(duì)照組之間的差異,顯著性水平P＜0.05、P＜0.01 時(shí)為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 NP 對(duì)斑馬魚的急性致死毒性

斑馬魚剛投入NP 的實(shí)驗(yàn)溶液時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象。 急性毒性暴露過程中,對(duì)照組和59.6 μg·L-1組的斑馬魚沒有出現(xiàn)死亡且生活狀態(tài)良好,高濃度的 1 000 μg·L-1組在 24 h 內(nèi)全部死亡。 NP 對(duì)斑馬魚的24 ~96 h 的LC50數(shù)據(jù)如表1 所示。 暴露1 h后發(fā)現(xiàn) 625、790 和 1 000 μg·L-1組的斑馬魚大部分聚集在水底,游動(dòng)緩慢,向上游動(dòng)仍會(huì)下沉,觸碰后反應(yīng)正常;暴露5 h 后1 000 μg·L-1組的魚沉底情況沒有好轉(zhuǎn),游泳遲緩,搖擺無力,部分在水底不游動(dòng),且呼吸急促。 死亡個(gè)體在死前的癥狀各組基本一致,逐漸喪失平衡能力,出現(xiàn)側(cè)翻、傾斜,在水底的個(gè)體腹部朝上,仍有微弱呼吸,但觸碰無反應(yīng)。 當(dāng)天死亡個(gè)體的魚鰓和頭下部常伴隨紅腫,而之后死亡的個(gè)體則較少出現(xiàn)這種情況,外表無明顯損傷,少部分魚身會(huì)發(fā)生彎折。

表1 壬基酚(NP)對(duì)斑馬魚的急性半致死濃度(LC50)Table 1 Acute medial lethal concentration (LC50) of nonylphenol (NP) on zebrafish

2.2 NP 對(duì)斑馬魚體內(nèi)SOD 活力的影響

斑馬魚不同組織中的可溶性蛋白質(zhì)含量的平均值分別為 33.5 g·L-1(魚頭)、36.0 g·L-1(肌肉)、93.5g·L-1(內(nèi)臟團(tuán))。 對(duì)照組 SOD 活力在 3個(gè)組織的大小關(guān)系為內(nèi)臟團(tuán)(7.0 U·mg-1)＜頭部(21.3 U·mg-1)＜肌肉(41.5 U·mg-1)。 斑馬魚不同組織內(nèi) SOD 與對(duì)照組的相對(duì)活力變化(%)如圖1 所示,5 μg·L-1組頭部的SOD 活力在暴露1 d 時(shí)被顯著誘導(dǎo)(P＜0.01),表現(xiàn)出毒性興奮效應(yīng),50 μg·L-1組在脅迫14 d 時(shí)受到輕微抑制,此外各組在暴露期間無顯著變化。進(jìn)入凈化階段,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的 SOD活力呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)效應(yīng)(P＜0.05)后均有下降,100 μg·L-1組在凈化 7 d 時(shí)仍高于對(duì)照水平(P＜0.05)。 肌肉部分,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的 SOD 活力在暴露 7 d 時(shí)受到顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),而 5 μg·L-1組在暴露14 d 受到顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),此時(shí)其余2 組已恢復(fù)對(duì)照水平。 5 μg·L-1組在凈化初期受到的誘導(dǎo)作用顯著(P＜0.01),50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的SOD 活力在凈化 7 d 時(shí)低于對(duì)照水平(P＜0.05)。 5 μg·L-1組內(nèi)臟團(tuán)中SOD 活力在前期低于對(duì)照水平,各組在暴露14 d 時(shí)均受到顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),100 μg·L-1組在7 d 已較早出現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng)。 肌肉和內(nèi)臟中SOD 活力在高濃度組出現(xiàn)轉(zhuǎn)變的時(shí)間要早于低濃度組。 凈化階段,內(nèi)臟團(tuán)的SOD 活力呈現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。 各組織內(nèi)SOD 的相對(duì)活力在暴露和凈化期的變化范圍為85.1% ~117.4%,整體而言,斑馬魚體內(nèi)的SOD 活力變化對(duì)NP 不太敏感。

圖1 在暴露與凈化過程中NP 對(duì)斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內(nèi)臟團(tuán)(c)中超氧化物歧化酶(SOD)相對(duì)活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對(duì)照組水平為100%。Fig.1 Effect of NP on relative superoxide dismutase (SOD) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.3 NP 對(duì)斑馬魚體內(nèi)CAT 活力的影響

斑馬魚不同組織內(nèi)CAT 與對(duì)照水平的相對(duì)活力(%)變化如圖2 所示。 對(duì)照組的CAT 活力在3個(gè)部分的大小關(guān)系依次為肌肉(0.42 U·mg-1)＜頭部(0.54 U·mg-1)＜內(nèi)臟團(tuán)(5.8 U·mg-1)。 各組頭部的CAT 活力在初期均受到不同程度的抑制,在暴露7 d 時(shí)上升到對(duì)照水平(P＞0.05),在14 d 又受到顯著抑制。 進(jìn)入凈化階段,5 μg·L-1和 50 μg·L-1組的CAT 活力均恢復(fù)上升到對(duì)照水平,而100 μg·L-1組在凈化7 d 時(shí)仍顯著低于對(duì)照水平(P＜0.05)。 50 μg·L-1和 100 μg·L-1組肌肉內(nèi)的 CAT 活力在暴露 7 d時(shí)受到顯著誘導(dǎo)(P＜0.05),隨后恢復(fù)到對(duì)照水平(P＞0.05)。 從平均水平看,100 μg·L-1組的 CAT 活力下降到對(duì)照水平以下,而5 μg·L-1仍高于對(duì)照水平,不同NP 濃度組肌肉內(nèi)的CAT 活力變化在時(shí)間上也存在差異。 在暴露1 d 和7 d 時(shí),NP 對(duì)內(nèi)臟部分的 CAT 活力造成不同程度的抑制(P＜0.01)。 100 μg·L-1組受到NP 的抑制程度明顯大于其他組,并且在14 d 時(shí)仍顯著低于對(duì)照水平,此時(shí)5 μg·L-1和50 μg·L-1組的 CAT 活力已基本恢復(fù),5 μg·L-1組甚至超過了對(duì)照水平(P＜0.01)。 在凈化期內(nèi),100 μg·L-1組相較于低濃度組恢復(fù)較慢。 整體而言,內(nèi)臟團(tuán)CAT 活力對(duì) NP 較為敏感,100 μg·L-1組的相對(duì)活力在暴露7 d 時(shí)低至15.5%。

圖2 在暴露與凈化過程中NP 對(duì)斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內(nèi)臟團(tuán)(c)中過氧化氫酶(CAT)相對(duì)活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對(duì)照組水平為100%。Fig.2 Effect of NP on relative catalase (CAT) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.4 NP 對(duì)斑馬魚體內(nèi)GST 活力的影響

斑馬魚不同組織內(nèi)GST 與對(duì)照水平的相對(duì)活力(%)受NP 影響的變化規(guī)律如圖3 所示。 對(duì)照組的GST 活力在3個(gè)部分的大小關(guān)系依次為內(nèi)臟團(tuán)(6.5 U·mg-1)＜肌肉(14.7 U·mg-1)＜頭部(18.7 U·mg-1)。 5 μg·L-1組頭部的 GST 活力在 14 d 暴露期內(nèi)持續(xù)低于對(duì)照水平,而50 μg·L-1和100 μg·L-1組受到不同程度的誘導(dǎo),并且在凈化1 d 后仍高于對(duì)照水平。 肌肉組織中,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組在暴露和凈化初期均受到顯著誘導(dǎo),其余時(shí)間變化不顯著(P＞0.05)。 除了 5 μg·L-1和 50 μg·L-1組在暴露期1 d 受到抑制,各組內(nèi)臟團(tuán)的GST 活力在NP脅迫下均受到誘導(dǎo)作用,且各組GST 活力均隨時(shí)間增長(zhǎng)而增大。 5 μg·L-1組在 14 d 時(shí)達(dá)到平衡,為對(duì)照水平的 218.8% ~220.0%;50 μg·L-1的 GST 活力增速漸緩,而100 μg·L-1組未見趨于平衡,且相對(duì)活力在14 d 時(shí)已高達(dá)328.4%。 各組織內(nèi)GST 活力進(jìn)入凈化階段后逐漸恢復(fù)對(duì)照水平,低濃度組恢復(fù)較快。 在本研究的濃度范圍內(nèi),NP 對(duì)GST 沒有造成不可逆的影響。

圖3 在暴露與凈化過程中NP 對(duì)斑馬魚頭部(a)、肌肉(b)和內(nèi)臟團(tuán)(c)中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相對(duì)活力的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對(duì)照組水平為100%。Fig.3 Effect of NP on relative glutathione S-transferase (GST) activities in head (a), muscle (b) and visceral mass (c) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

2.5 NP 對(duì)斑馬魚體內(nèi)GSH 含量的影響

GSH 在斑馬魚頭部和肌肉中的相對(duì)含量(%)受NP 影響的變化情況如圖4 所示。 由圖4 可知,頭部對(duì)照水平的 GSH 含量(0.45 nmol·mg-1)小于肌肉(1.03 nmol·mg-1)。 由于 GSH 含量測(cè)定所需的樣品量較大,故樣品量較少的內(nèi)臟團(tuán)沒有進(jìn)行測(cè)定。 50 μg·L-1組頭部的 GSH 含量在 NP 脅迫下高于對(duì)照水平,除此之外,各組在斑馬魚體內(nèi)的GSH 含量在暴露7 d 前均顯著低于對(duì)照水平(P＜0.05),且隨時(shí)間增長(zhǎng)而增加。 頭部的GSH 含量在凈化期內(nèi)下降到對(duì)照水平;對(duì)于肌肉部分,50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的GSH 含量在凈化7 d 時(shí)仍顯著高于對(duì)照水平(P＜0.05)。

圖4 在暴露與凈化過程中NP 對(duì)斑馬魚頭部(a)和肌肉(b)中還原型谷胱甘肽(GSH)相對(duì)含量的影響注:*表示P＜0.05,**表示P＜0.01;輔助線前后表示暴露期和凈化期,以對(duì)照組水平為100%。Fig.4 Effect of exposure to NP on relative glutathione (GSH) level in head (a) and muscle (b) of zebrafish during exposure and purification stagesNote: *represents P＜0.05, **represents P＜0.01; auxiliary line separates exposure and purification stages; control treatment level is set at 100%.

3 討論(Discussion)

對(duì)于需氧生物而言,在對(duì)外源污染物的代謝過程中,會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物ROS,機(jī)體主要通過SOD、CAT等抗氧化酶消除ROS 以避免氧化損傷[14]。 GST 也有抗氧化和解毒的重要功能,催化GSH 與外源污染物以及代謝產(chǎn)生的親電試劑結(jié)合,避免其對(duì)機(jī)體DNA、蛋白質(zhì)和酶等重要物質(zhì)造成損傷[19]。

魚鰓是魚類與水接觸的直接組織,是攝取水中NP 的主要途徑[20]。 此前有研究表明 NP 可以引起玫瑰無須鲃的鰓和肝腎的結(jié)構(gòu)病變,表現(xiàn)出上皮組織的增生和次級(jí)鰓片的融合,以及肝腎出血和細(xì)胞壞死,這可能要?dú)w咎于疏水性的NP 與細(xì)胞膜結(jié)合改變其通透性,繼而造成細(xì)胞泄露和離子損失等[21]。NP 使斑馬魚魚鰓組織產(chǎn)生增生和紅腫,繼而影響其呼吸效率。 除此之外,NP 的暴露還可以破壞機(jī)體內(nèi)促氧化劑與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并造成細(xì)胞毒性。 引起斑馬魚急性死亡的主要原因可能是鰓部呼吸功能的嚴(yán)重受損導(dǎo)致缺氧,內(nèi)部肝、腎等臟器的功能障礙以及生理機(jī)能下降加速死亡。NP 對(duì)斑馬魚24 h 和96 h 的LC50值與陳建華等[22]的研究結(jié)果(545 μg·L-1和 332 μg·L-1)相近,而張靜[23]報(bào)道的96 h LC50(雌、雄斑馬魚LC50分別為902 μg·L-1和 529 μg·L-1)明顯大于本研究結(jié)果,可能是因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)水溫(28 ℃)對(duì)斑馬魚更為適宜以及采用對(duì)魚類毒性更小的二甲基亞砜(DMSO)作為助溶劑。NP 通過誘導(dǎo)氧化損傷和直接改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)等多種方式對(duì)斑馬魚造成了毒性作用。

NP 對(duì)幼年泥鰍SOD 和CAT 活力的誘導(dǎo)作用隨濃度增加而增強(qiáng),到達(dá)最高后表現(xiàn)出隨NP 濃度增加而下降的趨勢(shì)[24]。 本研究中沒有發(fā)現(xiàn)SOD 和CAT 活力存在明顯的濃度依賴性。 在NP 對(duì)櫛孔扇貝的急性脅迫下,鰓組織和消化盲囊中SOD、CAT的活力在低、中濃度脅迫下先受到輕微誘導(dǎo)后被抑制,而高濃度下全程表現(xiàn)為抑制作用[25]。 Abd-Elkareem 和Mohamed 發(fā)現(xiàn)非洲鲇魚和尼羅河羅非魚經(jīng)NP 暴露 21 d 后,SOD 和 CAT 活力顯著下降[3]。 本研究結(jié)果表明,斑馬魚頭部的SOD 活力在低濃度脅迫下受到誘導(dǎo),雖然后期在頭部和肌肉中表現(xiàn)出的抑制效應(yīng)與其他研究一致,但抑制程度較小。 肌肉中CAT 活力也表現(xiàn)出先被誘導(dǎo)后受到輕微抑制;頭部由于通過鰓部吸收水中NP,CAT 活力受到的抑制作用更強(qiáng)而始終低于對(duì)照水平。 波紋巴非蛤外套膜中SOD 活力在NP 脅迫下整體表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制,進(jìn)入凈化階段僅1 μg·L-1低濃度組恢復(fù)至對(duì)照水平[26]。 NP 對(duì)波紋巴非蛤毒性效應(yīng)的研究結(jié)果與本研究相似,由于鰓部是吸收水中NP 的主要途徑,而肌肉是繼頭部和內(nèi)臟后最遲受NP 脅迫的組織[27],因此頭部和肌肉內(nèi)SOD 的誘導(dǎo)效應(yīng)產(chǎn)生的時(shí)間存在先后。 在NP 對(duì)波紋巴非蛤內(nèi)臟團(tuán)的脅迫過程中,1 μg·L-1和 10 μg·L-1組的 SOD 活力先被抑制后受到誘導(dǎo)[28]。 本研究結(jié)果中,SOD 和 CAT 在頭部和肌肉中的活力在暴露后期隨體內(nèi)NP 積累濃度增加和脅迫時(shí)間持續(xù)均會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。 內(nèi)臟團(tuán)中的SOD 和CAT 活力在前期受抑制后均表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。 由于不同組織內(nèi)抗氧化酶的敏感性和賦存含量有差異,NP 對(duì)抗氧化酶的誘導(dǎo)/抑制效應(yīng)及其影響程度、變化時(shí)間均有所不同。

進(jìn)入機(jī)體的NP 濃度隨時(shí)間增加,在NP 脅迫下機(jī)體產(chǎn)生大量ROS 和其他中間產(chǎn)物,進(jìn)而使得抗氧化酶、非酶類抗氧化物質(zhì)被大量消耗[29]。 低濃度組斑馬魚頭部的GST 活力在暴露階段受到不同程度的抑制,而GSH 的含量并未被大量消耗而低于對(duì)照水平,這一結(jié)果符合GSH 在GST 的催化作用下與活性成分結(jié)合導(dǎo)致其含量變化。 波紋巴非蛤外套膜內(nèi)GSH 含量在前中期基本低于對(duì)照組,15 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組[26]。 本研究中斑馬魚頭部和肌肉中GST 的活力在暴露7 d 和14 d 呈現(xiàn)誘導(dǎo)作用或無顯著變化,可見GST 的催化反應(yīng)并未受到抑制,而底物GSH 的含量卻保持增長(zhǎng)并在14 d 高于對(duì)照水平,這表明GSH 的總量出現(xiàn)了延遲性的增長(zhǎng)。 大嘴鱸魚體內(nèi)GSH 生物合成在NP 暴露下表現(xiàn)出上升趨勢(shì)[30],斑馬魚體內(nèi)的GSH 含量在NP 持續(xù)脅迫下也會(huì)通過合成使總量增加。

斑馬魚肌肉中的SOD 和CAT 活力隨暴露時(shí)間增加逐漸被誘導(dǎo),隨后表現(xiàn)出活力的下降,尤其是高濃度組比低濃度組更早發(fā)生下降的轉(zhuǎn)變。 機(jī)體內(nèi)NP 的積累濃度隨暴露時(shí)間增加,且在高濃度下積累速度更快[13],可見NP 對(duì)抗氧化酶的影響與體內(nèi)的積累濃度存在相關(guān)性。 內(nèi)臟團(tuán)SOD 活力在100 μg·L-1中更早地從受抑制轉(zhuǎn)為被誘導(dǎo),同樣與NP 的積累濃度有關(guān)。 NP 會(huì)對(duì)貽貝體內(nèi)GST 的活力產(chǎn)生劑量依賴性的誘導(dǎo),并且在凈化期持續(xù)作用[31]。 斑馬魚頭部GST 活力水平也表現(xiàn)出一定的濃度依賴性,但 50 μg·L-1和 100 μg·L-1組的差異并不顯著。內(nèi)臟團(tuán)GST 活力表現(xiàn)出時(shí)間依賴性,并且5 μg·L-1組的GST 活力在暴露期維持一定水平,同時(shí)50 μg·L-1組的GST 活力增速漸緩,表明內(nèi)臟團(tuán)的GST 活力會(huì)隨體內(nèi)NP 濃度的平衡而維持在相應(yīng)水平,該水平與暴露濃度呈正相關(guān)。 結(jié)合GST 活力與時(shí)間以及暴露濃度的關(guān)系,可知斑馬魚體內(nèi)NP 的積累濃度是誘發(fā)GST 活力改變的主因,而不是體外的脅迫濃度,體內(nèi)的GST 活力隨NP 暴露時(shí)間和暴露濃度變化而增強(qiáng),其誘導(dǎo)作用表現(xiàn)出與體內(nèi)NP 濃度相關(guān)的劑量效應(yīng)[13]。 本研究中內(nèi)臟團(tuán)的GST 活力變化與野生貽貝的相同,表明內(nèi)臟團(tuán)中的GST 積極參與了NP 的代謝解毒過程,其活力變化對(duì)NP 的敏感性遠(yuǎn)大于頭部和肌肉,證實(shí)了肝、腎作為代謝解毒的主要功能器官。 GST 活力受到抑制一般有2 種可能的原因:NP 與 GST 結(jié)合或 NP 使催化底物GSH 的含量減少。 頭部 GST 在 5 μg·L-1組的活力低于對(duì)照水平,同時(shí)GSH 的含量卻沒有明顯下降,表明頭部GST 活力下降的原因可能是低濃度水平的NP 通過結(jié)合GST 使其活力下降[32],高濃度NP使GST 活力上升可能是因?yàn)镹P 在短期內(nèi)達(dá)到一定水平后激活了相關(guān)代謝酶的活動(dòng)。 抗氧化酶的活力變化依賴于體內(nèi)NP 的積累濃度和一定濃度水平的維持時(shí)間。

綜上所述,NP 對(duì)斑馬魚表現(xiàn)出中等毒性,斑馬魚內(nèi)臟團(tuán)中的CAT 和GST 的活力變化能較好地反映體內(nèi)NP 積累濃度的變化,頭部的抗氧化酶活力變化可作為NP 早期污染的敏感指標(biāo)。