新生昆明小鼠生長發育過程中背部毛囊發育變化

郭麗麗，王東陽 ，朱坤龍 ，魏宇豪，李樹偉,*

（1塔里木大學生命科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

皮膚是哺乳動物最大的器官之一［1］，毛囊是皮膚衍生物。毛囊具有獨特的立體空間結構及周期性的再生功能，靜止狀態的毛囊細胞在皮膚出現損傷后，表現出迅速增殖和多向分化的潛能，迅速修復壞死損傷的表皮、毛囊、皮脂腺等，而具體行使修復功能的細胞及調控機制研究尚且不清楚［2］。毛囊是皮膚附屬器之一，是哺乳動物成體中最重要的且處于不斷再生狀態的器官之一，循環經歷著生長期、退行期和休止期［3］。毛囊的生長發育分期，對研究毛囊生長發育具有重要意義［4］。毛囊屬于哺乳動物皮膚的重要結構和功能亞器官［5］，具有獨特的可再生能力和高度的自我更新能力，毛囊細胞經增殖分化成熟后最終形成毛發。不同動物的毛囊形態各有不同，但都具有毛球、毛干、內根鞘、外根鞘等基本結構［6］。國內外對胚胎小鼠的毛囊［7］及出生后不同肢體部位的毛囊，從形態學及發育周期做了相關的研究［8］，而對出生后小鼠在不同生長時期毛囊發育變化規律的研究較少，對隨著小鼠生長周期變化，毛囊生長發育周期差異缺乏深入研究，對隨著小鼠年齡的增加，毛囊、毛干生長發育發生巨大變化的研究目前尚不清楚。

本研究通過組織切片技術對小鼠出生后第1～12 d背部皮膚組織結構特征進行觀察。利用新生同一窩小鼠生長發育的同時性、同步性，通過組織切片技術觀察其背部毛發變化并進行組織形態學差異分析，研究新生小鼠背部皮膚毛發隨年齡增加，毛干及毛囊生長發育出現的變化規律。為進一步探索皮膚毛囊發育差異及其調控機制提供一定的試驗參考，同時通過觀察毛囊發育的規律，為后期研究藥物對毛囊發育的影響及創面愈合修復皮膚毛囊再生的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠毛囊樣品采集

選取妊娠晚期雌性昆明小鼠6只，來源于塔里木大學動物科學與技術學院實訓基地。分籠單獨飼養，分娩后開始隨機采集5只新生小鼠背部皮膚樣本，后期于同一時間點處死5只小鼠，將分別采集出生后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d小鼠的背部皮膚組織樣本，一部分保存至-80℃冰箱備用，另一部分保存至液氮罐中備用。

1.1.2 主要試劑與儀器

試驗儀器：LEICA S6E解剖顯微鏡（德國LEICA公司），MODEL Ckx41SF倒置顯微鏡（日本Olympus公司），LEICA組織攤片拷片機（德國LEICA公司），HODIIBOXUN超凈工作臺上（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），LEICA冰凍切片機（德國LEICA公司），麥克奧迪可視化顯微鏡（廈門麥克奧迪醫療診斷有限公司）。

試驗試劑：OCT冰凍包埋劑，購自美國Gibco公司；蘇木精、伊紅，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；多聚甲醛（PFA）、無水乙醇等生化常規試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 獲取標本及保存方法

新生小鼠，1～12 d每日采樣，采用頸椎脫臼法處死新生小鼠，操作過程中嚴格遵循動物倫理保護法，將小鼠于75%乙醇溶液消毒60 s，隨即轉移至超凈工作臺中，剃毛后利用顯微外科剪分離新生小鼠背部皮膚，切成8 mm×8 mm皮片，并將游離皮片轉移至超凈工作臺上。OCT組織包埋，一部分皮片緊貼包埋盒側壁，用鑷子移動皮片至包埋盒中央并與底面垂直，編號記錄縱切皮片，最后將包埋樣本轉移至-80℃冰箱冷凍24 h備用。取出冰凍OCT組織包埋樣本并使用德國徠卡切片機，制作15μm厚度的毛囊縱向組織切片。一部分皮片緊貼包埋盒底面，用鑷子移動皮片至包埋盒中央并與底面平行，編號記錄橫切皮片，最后將包埋樣本轉移至-80℃冰箱冷凍24 h備用。取出冰凍OCT組織包埋樣本并使用德國徠卡切片機，制作15μm厚度的毛囊橫向組織切片。

1.2.2 HE常規染色

將保存于-80℃冰箱的縱向、橫向組織切片盒取出，于組織攤片拷片機上在溫度40℃條件下晾干10 min，移入染色盒內，蒸餾水浸潤3 min；滴加蘇木素染色5 min；蒸餾水漂洗1 min，待載玻片上多余的蘇木素染液明顯漂洗干凈后；再移入染色盒，滴加1%鹽酸乙醇分化5 s，移入清洗盒，蒸餾水漂洗1 min；再移入染色盒，滴加伊紅染色30 s；移入清洗盒，蒸餾水漂洗2 min，洗凈載玻片上多余的伊紅染液；于50%、75%、100%的乙醇中順濃度梯度各浸泡20 s；使用Histoclear透明劑透明6 s；移入組織切片盒，自然晾干后中性樹膠封片，轉移至麥克奧迪可視化顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 新生小鼠毛發生長形態觀察

觀察新生昆明小鼠1～12 d皮毛生長情況，可以發現剛出生的小鼠皮膚紅潤，肉眼看不到皮毛，直到出生后第5 d才可以觀察到小鼠背部長出細小的白色絨毛（見圖1）。

小鼠出生時背部皮膚有大量的褶皺，隨著日齡的增加，褶皺逐漸變淺，于7日齡褶皺消失。小鼠出生時背部皮膚為鮮紅色，隨著小鼠日齡的增長，皮膚顏色逐漸變淺，毛發逐漸發生變化，于5日齡可以觀察到小鼠背部長出細小的白色毛發，這種變化主要是毛發密度和毛發長度的增加。

2.2 新生昆明小鼠毛囊縱切面觀察

將不同日齡的小鼠皮膚樣本進行縱切，HE染色，用（40×、100×、200×、400×）顯微鏡觀察皮膚毛囊發育情況，可以發現毛囊長而直，在皮膚內斜向生長。毛球較毛干著色較深，真皮乳頭較清晰，根鞘完整，毛囊的長度隨著小鼠日齡的增加不斷增加（見圖2）。

觀察毛囊切片，利用分析軟件測量毛囊的深度，統計數據并進行差異顯著性分析，由圖3分析可知，昆明小鼠毛囊的深度隨著年齡的增長而不斷加深，這種隨著年齡增長不斷加深的趨勢主要集中在出生后1～7 d，在第7 d后逐漸趨于平穩。

圖3 新生昆明小鼠毛囊深度分析

2.3 新生昆明小鼠毛囊橫切面觀察

將不同日齡小鼠皮膚進行橫切，HE染色，觀察毛囊發育情況，可以發現毛囊的密度越來越大，數量不斷增加（見圖4）。

圖4 新生昆明小鼠毛囊橫切面觀察

分別于新生小鼠出生后第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d取樣，每次5只小鼠，每只小鼠皮膚橫切2個載玻片，進行HE染色，每個載玻片選取一個（400×）視野計數，由圖5的結果可知，昆明小鼠毛囊的數量隨著年齡的增長而不斷增加，這種隨著年齡增長毛囊數量增加的趨勢主要集中在出生后1～9 d，在第9 d后逐漸趨于平穩。

圖5 新生昆明小鼠毛囊計數

3 討論

目前國內外對皮膚毛囊的生長發育分化及毛囊的生長周期有相關的研究報道［9-10］，發現有關毛囊生長發育的調控信號通路［11］。皮膚在哺乳動物的體表起保護作用，是面積最大的器官［12］，其主要包括毛囊、皮脂腺、毛干等附屬結構。毛囊是一個形態和結構較為復雜的皮膚附屬器官，并且具有獨特的立體構象，其控制著毛發的生長，具有自我更新和周期性生長的特點。在皮膚分化發育的過程中，毛囊也按照固定的形式分階段分化發育成熟。毛囊在生長發育過程中受多種因子的共同調控［13-14］，這些相關調控因子主要包括：激素、細胞因子、神經肽等，毛囊周期包括三個階段：生長期、退化期、靜止期，毛囊在胚胎發育過程中形成，出生后毛乳頭變化較少，但是毛乳頭以外的其他成分不斷的循環變化［15］。

本試驗通過觀察發現昆明小鼠出生后1～12 d毛囊生長發育呈現出周期性變化，且處于同一生長時期的毛囊形態具有高度相似性。新生小鼠毛干及內根鞘處于比較活躍的狀態，小鼠毛囊密度、長度和深度在出生后一周發生急劇變化。小鼠毛囊生長初期，主要是毛囊長度增長，生長活躍，毛乳頭也隨之增長，深入真皮，毛球部明顯寬于毛根部；毛囊生長中期，毛囊縮短，毛乳頭致密；毛囊生長末期，毛囊萎縮，其底部成棒狀，毛干脫落，開始進入下一個毛囊周期，逐漸長出新毛。小鼠毛囊組織結構的變化規律及其調控機制有待進一步深入的分析研究。

綜上所述，小鼠皮膚及其附屬結構（毛囊）的急劇變化期發生在小鼠出生后的一周時間內，該時期具有顯著的表觀形態學變化。因此這個生長發育期可以作為毛囊及皮膚研究的最佳時期。毛囊及皮膚相關蛋白表達與發育成熟后的個體可能存在巨大的差異，并且毛囊及皮膚相關基因在轉錄水平與發育成熟后的個體可能同樣存在巨大的差異。本試驗的研究成果，可以為皮膚及毛囊的進一步深入研究提供理論參考。