響應面法優化庫爾勒香梨各部位總多酚提取工藝及抗氧化活性研究

仵菲，買里得爾·葉拉里，白紅進,*

（1新疆兵團南疆化工資源利用工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（2塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆庫爾勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)屬于白梨系統，是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus spp.）植物［1］，在新疆種植面積廣、年產量高，果實一般呈黃綠色并略帶紅色。香梨中含有多糖、酚類化合物、維生素等營養成分，具有潤肺、消痰、保肝利膽等功效［2］。

多酚類化合物是留存于植物中的次生代謝產物，在植物的果實、莖、葉中儲藏量非常豐富［3-4］，具有顯著的抗病毒、降血脂、清除自由基、保護心血管等作用，已經廣泛應用于食品和醫藥領域［5］。近年來，不斷有文獻報道，從紅棗［6］、煙草［7］、百香果［8］等植物中提取到多酚類物質，但對于庫爾勒香梨果實不同部位多酚提取工藝優化的研究較少。多酚類化合物的提取方法目前大多是超聲波輔助有機溶劑提取［9-12］，因為超聲輔助法可加快有機溶劑滲透到植物細胞中，縮短提取時間、提高提取率［13］。響應面法是目前常用的試驗優化方法，廣泛應用于農業、生物、食品、化學等領域［14-15］，其特點是試驗周期短、精密度高、預測性能好，并且能研究幾種因素交互作用［16］。目前對于評價植物體外抗氧化活性的方法有很多，其中DPPH自由基清除能力是一種靈敏、簡單易行的有效檢測方法［17］。

本試驗以新疆庫爾勒香梨為試材，選用乙醇為有機溶劑，采用超聲輔助法提取庫爾勒香梨果實不同部位中的總多酚，通過單因素試驗和響應面法優化提取工藝，通過DPPH自由基清除率測定其總多酚的抗氧化性能，掌握庫爾勒香梨果實不同部位總酚含量的分布情況，為新疆南疆庫爾勒香梨資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

供試材料為新疆庫爾勒香梨，采集于新疆阿拉爾市塔里木大學校園內（81°17′41.61″E，40°32′23.50″N），將采集的香梨洗凈后立即分離果皮、果肉、核外果肉和果核，-20℃保存備用。

沒食子酸（AR）購自天津市光復精細化工研究所；福林酚試劑（AR）購自Solarbio公司；無水乙醇（AR）、NaNO2（AR，≥99.8%）、Al(NO3)3（AR，≥99.8%）、NaOH（AR，≥99.8%）、Na2CO3（AR，≥99.0%）等，購自天津市致遠化學試劑有限公司；蘆丁（≥97.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；DPPH購自成都埃法生物科技有限公司。

N-1001旋轉蒸發儀，上海泉杰儀器有限公司；OSB-2100水浴熱鍋，上海泉杰儀器有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；BS124S電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV1800可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

參考周麗萍等［18］研究方法，在760 nm處測定吸光度值，橫坐標為沒食子酸濃度，縱坐標為吸光度值，獲得線性回歸方程：y=12.350x+0.115，相關系數r2=0.999。

1.2.2 庫爾勒香梨多酚的提取工藝

稱取一定量的樣品，加入70%的乙醇，料液比為1:15，50℃下超聲提取40 min，抽濾后取上清液濃縮，按1.2.1的方法重復測定3次吸光度值。計算公式如下：

式（1）中，E為香梨多酚提取量，mg/g；C為總多酚質量濃度，mg/g·FW；V為多酚提取液定容的體積，mL；N為稀釋倍數，W為庫爾勒香梨原料質量，g。

1.2.3 單因素試驗

在恒定的超聲功率條件下，考察乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度4個因素對庫爾勒香梨不同果實部位總多酚提取量的影響。固定其他3個因素，分別選取乙醇體積分數30%、40%、50%、60%、70%、80%，料液比 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，提取時間 20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，提取溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃進行單因素試驗［19-20］，確定超聲輔助提取庫爾勒香梨多酚的最適提取工藝參數。

1.2.4 響應面優化工藝

以單因素試驗的結果為基礎，運用Box-Behnken響應面法優化庫爾勒香梨果實各部位總多酚的提取工藝參數。以庫爾勒香梨果實總多酚提取量為響應值，選取乙醇體積分數（A）、料液比（B）、時間（C）確定庫爾勒香梨各部位總多酚的最佳提取工藝條件［21-22］。

1.2.5 DPPH自由基清除率

樣品組：取7支試管分別吸取1.00 mL不同濃度的樣品提取液與2.00 mL0.05 mmol/LDPPH溶液混勻；

對照組：1.0 mL無水乙醇與2.00 mL 0.05 mmol/L DPPH溶液混勻；

以無水乙醇作為空白對照，蘆丁作為陽性對照，于517 nm處測定吸光度值。

DPPH自由基清除率［23-24］計算式為：

式（2）中，Y為DPPH自由基清除率；A0為波長517 nm處空白樣品的吸光度值；A1為波長517 nm處樣品的吸光度值。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

線性回歸方程：y=12.350x+0.115，r2=0.999，如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 單因素試驗結果分析

由圖2可知，4個因素對庫爾勒香梨果實不同部位總多酚提取量的影響趨勢均呈現先增后減的趨勢，其中果皮和果核的變化趨勢較為明顯。由圖2（a）可以看出，隨著乙醇體積分數的升高，庫爾勒香梨果實不同部位的總多酚提取量呈現先增后減的趨勢，乙醇體積分數在70%左右總多酚的提取量最高，宋慧等［25］也證明了采用體積分數70%的乙醇溶液提取梨皮多酚效果最好，故選擇乙醇體積分數70%作為進一步工藝優化試驗條件；由圖2（b）可以看出，隨著料液比的增大，總多酚提取量先增加后降低，其中料液比為1:15時，庫爾勒香梨果實不同部位總多酚的提取量最高，故選擇料液比在1:15作為進一步工藝優化試驗范圍；由圖2（c）可以看出，隨著提取時間不斷延長多酚提取量先升高，40 min后逐漸下降，因此選擇提取時間30～50 min作為進一步工藝優化試驗范圍；由圖2（d）可以看出，隨著提取溫度不斷升高，總多酚的提取量呈先增加后減小的趨勢，在40℃時達到最高值，因此選擇30～50℃作為進一步工藝優化試驗范圍。

圖2 不同試驗因素對庫爾勒香梨果實各部位多酚提取率的影響

2.3 響應面優化總多酚提取工藝

利用Design Expert 8.0.6軟件分析得到的香梨果實各部位總多酚的多元二次回歸模擬方程如下式所示，其中，Y表示庫爾勒香梨果實總多酚含量的預測值，e為自然常數。

Y（果皮）=17.02+0.25A+0.021B-0.032C-2.500e-0.03AB-0.030AC-0.065BC-0.47A2-0.27B2-0.12C2

Y（果肉）=0.50+0.019A+3.750e-0.03+0.014C+0.020AB-7.250e-0.03AC-0.026BC-0.13A2-0.095B2-0.045C2

Y（核外果肉）=0.53+0.013A+0.012B+6.375e-0.03C+0.024AB+0.023AC-1.000e-0.03BC-0.15A2-0.13B2-0.10C2

Y（果核）=6.03+0.26A-0.032B+0.030C+0.14AB+0.015AC-0.090BC-1.09A2-0.57B2-0.48C2

庫爾勒香梨果皮中總多酚的響應面回歸模型的方差分析見表1。該模型的相關系數r2=0.988 3，P＜0.000 1（差異極顯著）；失擬項P值為0.463 0＞ 0.05（不顯著），表明模型的預測值與實測值擬合程度較高，因此該模型能夠預測庫爾勒香梨果皮總多酚提取量［26］。通過F值分析可知，各因素對總多酚提取量影響的大小順序為：乙醇體積分數（A）＞時間（C）＞料液比（B）。

表1 庫爾勒香梨果皮中多酚的回歸方程方差分析

庫爾勒香梨果肉中總多酚的響應面回歸模型的方差分析見表2。該模型的相關系數r2=0.849 6，P＜0.041具有顯著性；失擬項P 值0.105 7＞ 0.05（不顯著），說明擬合情況良好。通過F值分析可知，各因素對總多酚提取量影響的大小順序為：乙醇體積分數（A）＞時間（C）＞料液比（B）。

表2 庫爾勒香梨果肉中多酚的回歸方程方差分析

庫爾勒香梨核外果肉中總多酚的響應面回歸模型的方差分析見表3。該模型的相關系數r2=0.914 2，P＜0.005 4（差異極顯著）。該模型的純誤差均方和較小為4.480e-0.05，說明此模型有效，應用響應面發優化提取香梨總多酚的提取工藝可行［27］。通過F值分析可知，各因素對總多酚提取量影響的大小依次為：乙醇體積分數（A）＞料液比（B）＞時間（C）。

表3 庫爾勒香梨核外果肉中多酚的回歸方程方差分析

庫爾勒香梨果核中總多酚的響應面回歸模型的方差分析見表4。該模型決定系數r2=0.995 3，P＜0.000 1（差異極顯著）；失擬項P值0.394 9＞0.05（不顯著），說明實測值與預測值之間擬合程度較高。該模型的純誤差均方和較小為5.170e-0.03，說明此模型有效，應用響應面法優化提取香梨總多酚的提取工藝可行［28］。通過F值分析可知，各因素對總多酚提取量影響的大小依次為：乙醇體積分數（A）＞料液比（B）＞溫度（C）。

表4 庫爾勒香梨果核中多酚的回歸方程方差分析

2.4 模型驗證試驗

將庫爾勒香梨果實總多酚的最佳提取條件調整為體積分數70%的乙醇，料液比為1:15，溫度40℃下提取40 min，在此工藝條件下得到果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚的提取量分別為(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW和(6.100±0.200）mg/g·FW（試驗3次取平均值），與預測值16.985 mg/g·FW、0.507 mg/g·FW、0.538 mg/g·FW和5.974 mg/g·FW，實測值與預測值之間差距不大，說明該模型可行有效。

2.5 抗氧化活性的測定

由圖3可知，在試驗濃度范圍內，庫爾勒香梨果肉、核外果肉和果核中總多酚對DPPH自由基的清除效果低于蘆丁，但隨濃度的增加，對DPPH自由基的最大清除率達50%～70%，果皮對DPPH自由基的清除效果大于陽性對照（蘆丁）試驗為85%，隨著濃度的增加，兩者的清除率趨于接近。由圖4可知，IC50值越小抗氧化活性越強，各部位的抗氧化活性由強到弱的次序為：果皮＞果核＞核外果肉＞果肉。綜上分析，庫爾勒香梨果皮的多酚對DPPH自由基有明顯（P＜0.05）的清除效果。

圖3 庫爾勒香梨果實各部位多酚對DPPH自由基的清除率

圖4 庫爾勒香梨果實各部位多酚對DPPH自由基的IC50值

3 結論與討論

本試驗以庫爾勒香梨為試材，采用超聲輔助提取法提取其果實不同部位中的總多酚，通過單因素和響應面工藝優化試驗確定了影響香梨不同部位中總多酚的最佳提取工藝為乙醇體積分數70%，料液比1:15，提取時間40 min，提取溫度40℃，庫爾勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚的提取量分別為(17.060±0.400)mg/g·FW、(0.532±0.053)mg/g·FW、(0.530±0.032)mg/g·FW、(6.100±0.200)mg/g·FW，蘇艷麗等［29］以100%的甲醇為溶劑，采用超聲輔助提取法測得的梨果多酚提取量為0.0564 mg/g，相比之下，本研究采用乙醇為溶劑不僅毒性小且多酚提取效果更好。庫爾勒香梨果皮、果肉、核外果肉和果核中總多酚對DPPH自由基清除率最高時分別為85%、60%、67%、72%，且IC50值從低到高次序為：果皮＞果核＞核外果肉＞果肉，故新鮮庫爾勒香梨果皮中總多酚含量較高且抗氧化能力較強，高于宋慧等［25］研究的梨皮多酚的DPPH自由基清除率。目前隨著對庫爾勒香梨果實酚類物質的深入研究，對于香梨不同果實部位酚類物質的開發日益上升，但是對庫爾勒香梨果實不同部位多酚提取工藝的研究較少，故本試驗可為梨品種總多酚的提取提供技術參考，為進一步開發天然抗氧化劑提供理論依據。