新品種柳樹幼苗耐鹽性評價與耐鹽指標篩選

楊遷, 楊寶山, 秦光華, 王惠*, 石家興, 劉雪婷

(1．濟南大學 水利與環境學院, 山東 濟南 250022；2．山東省林業科學研究院, 山東 濟南 250014)

由于不合理的土地資源利用以及自然條件、氣候等因素的影響，鹽堿化已經影響到地球上20%的可耕地。據估計，到2050年多達50%的灌溉土地將被鹽堿化[1]，作為主要的非生物脅迫之一，土壤鹽分會引起滲透失衡、離子毒害及氧化應激反應，從而抑制植物生長發育。

柳樹主要生長在北半球的寒溫帶地區，因其廣泛的生態適應性，在我國大部分地區均有分布，具有易繁殖、生長快、喜光喜濕、耐寒耐鹽等優良品質[2]，可作為重要的園林綠化、生物燃料和用材樹種。有研究表明，柳樹在耐受干旱、鹽堿和重金屬脅迫方面都有良好的表現[3]。根據閾值斜率模型，楊柳科一般被認為是中度敏感到中度耐鹽植物，種內及種間具有較大差異性。Hangs等[4]比較了37個不同本地和外來柳樹品種在不同鹽分土壤上的相對耐鹽性，發現大多數柳樹品種能夠耐受中等鹽漬土壤(土壤電導率≤ 5.0 dS/m)，其中6個品種甚至在高鹽度水平下(土壤電導率≤ 8.0 dS/m)都能保持較好的生長，表明柳樹可作為鹽漬土地建立短輪伐期綠皮林的優質候選樹種。

對柳樹耐鹽性快速高效的評價方法與科學合理的評價體系的研究，是篩選速生耐鹽柳樹品種，開發優質柳樹種質資源必不可少的環節之一。近年來國內對耐鹽植物的篩選工作主要集中在耐鹽指標的篩選和部分栽培種的耐鹽性評價等方面[5]。植物耐鹽是一個涉及形態、生理和生化變化的復雜過程，任何一種單項指標都難以對植物耐鹽性做出準確有效的評價，因此，采用多指標體系和多生長時期對植物品種進行耐鹽能力的篩選具有重要的意義[6]。常用的植物耐鹽能力綜合評價的方法很多，目前多用主成分分析、灰色關聯分析、聚類分析等一種或多種聯用作為植物耐鹽性評價方法，從而獲得更加全面有效的評價結果。李佳迪等[7]以梯度鹽脅迫處理下的5種柳樹無性系幼苗為材料，測定莖葉生物量等16個與耐鹽性有關的指標，利用隸屬函數法、主成分分析法和逐步回歸分析對柳樹苗期耐鹽性進行綜合評價以及耐鹽性指標篩選，通過最優回歸方程得出過氧化物酶活性、蒸騰速率、丙二醛含量這3個指標與柳樹耐鹽性評價最為密切相關。但鮮有對不同評價方法展開系統研究。

本文以山東省林業科學研究院培育出的三種新品種柳樹幼苗為材料，采用等權灰色關聯度分析、熵權灰色關聯度分析、主成分分析和主成分-灰色關聯度分析四種耐鹽性分析方法展開評價并做出對比，研究其在不同鹽濃度下的耐鹽性，同時基于其中3種評價方法與聚類分析，篩選出用于柳樹耐鹽性科學評價的重要生理指標，為挑選具有耐鹽潛力的柳樹品種提供科學合理的評價策略，為鹽漬土地利用及植物修復發掘優質材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗三種柳樹材料為J172(Salixmatsudana′J172′，培育代號A7)、無絮柳1號(Salixmatsudana′Wuxu1′，培育代號A34，雄株)、濕地柳1號(Salixmatsudana′Shidi1′，培育代號A42)。由山東省林業科學研究院實驗苗圃提供。

1.2 實驗設計

本實驗采用NaCl水培脅迫，2018年8月25日將苗圃當天提供的一年生柳樹枝條截成20 cm長的插條，前期使用自來水，后采用50%濃度Hoagland營養液分別培養三周后，選擇長勢一致的插條進行5種不同濃度NaCl脅迫處理(脅迫前稱取整株鮮重)。NaCl濃度根據前期培育數據設置，分別為0(50%Hoagland 營養液，CK)、20、40、60、80 mmol/L，每個處理設置3次重復，每個重復栽植兩顆柳樹插條。培養過程中每2周更換一次含有NaCl的營養液，期間每天添加蒸餾水以補充蒸發所損失的水分。

1.3 指標測定及方法

脅迫進行30 d后收獲植株，收獲植株前一天在北京時間10:00—16:00期間，用全自動便攜式光合系統(LC pro-SD，ADC，Hoddesdon)測定各個處理柳樹幼苗3片成熟葉片凈光合速率。收獲后分別稱取植株整株、地上部、根部鮮重計算生物量變化(單位：g)及根冠比，其中生物量變化為脅迫前后整株鮮重差值，根冠比為地上部分鮮重和根部鮮重的比值。并對其葉片葉綠素a+b含量、類胡蘿卜素含量、相對含水率、過氧化氫酶(CAT)活性、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性、愈創木酚過氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量、相對電導率、游離脯氨酸含量[8]、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、過氧化氫(H2O2)含量[9]指標進行測定(OSID附表1)。

1.4 耐鹽性綜合評價方法

本文以15項生長生理指標為依據，分別采用等權灰色關聯度法、熵權灰色關聯度法、主成分分析法和主成分-灰色關聯度法4種客觀分析方法對三種柳樹幼苗在4種NaCl濃度下的耐鹽性進行排序及分析評價。此外還計算了各指標4個鹽濃度下的平均值，將其列為3個品種的綜合樣本，以表現各柳樹品種的綜合耐鹽性，后續圖表中分別以A34、A42、A7表示。

1.4.1 等權灰色關聯度法

灰色關聯度分析通過對系統統計數列幾何關系的比較來分析系統中多因素間的關聯程度[10]，所需樣本量小、科學合理、簡便易行，在數據分析上不受數學理論分布的限制，近幾年被廣泛用于種質資源創新及新品種選育[11]。本文所選取的15個指標只是植物眾多抗鹽性狀中的一部分，還有很多諸如酚類和黃酮類等激素含量、葉綠素熒光參數、鈉鉀離子含量等數據未列入其中，故采取灰色關聯法計算關聯度進行排序，可以有效彌補樣本的缺少和信息的缺失。

為了消除量綱及單位對評價指標的影響，利用隸屬函數法[12]對15項性狀指標進行規范化處理，建立最優耐鹽性的參考品種X0j，選取各性狀所測定參數的最優值，無量綱處理后各指標值均為1。根據公式(1)、(2)可計算出等權灰色關聯度(OSID附表2)，并進行排序。

Δij=|Xij-Xmaxj|，ξij=(miniminjΔij+ρmaximaxjΔij)/(Δij+ρmaximaxjΔij)，

(1)

(2)

式中：Xij表示第i個樣本的第j個性狀；Xmaxj為各性狀最大值；minminΔij為二級最小差；maxmaxΔij為二級最大差；ξij為關聯系數；ri為等權灰色關聯度；ρ∈[0,1]為分辨系數，本文取0.5。

1.4.2 熵權灰色關聯度法

灰色原始關聯度分析雖然具有其獨特優勢，但計算中存在指標平權和專家賦值的局限性，熵權法建立在指標觀測值的基礎上，以各參評項目在指標數列中的區分度來確定權重。劉瑞顯等[13]把熵權法和灰色關聯度法的優點相結合，建立了基于熵權理論的灰色關聯度法，用于棉花耐鹽性評價和指標篩選。本文借鑒此種方法，旨在克服各性狀權重主觀賦值的局限性以及平權賦值的不合理性，實現對品種更為客觀的綜合評價。

參考費智聰[14]方法，計算第j個評價指標的熵值權重系數Ej，并對熵權-灰色關聯度值進行排序。

1.4.3 主成分分析法

主成分分析法是通過降維的辦法，把大批指標轉化為少數幾個能夠反映原始變量主要信息的綜合指標，每個綜合指標所含信息互不相關，使得到的結果更加科學有效[15]。

參照劉翔宇等[16]方法進行主成分分析，其中與耐鹽性呈負相關指標包括相對電導率、MDA含量、H2O2含量，對其進行倒數化處理。

1.4.4 主成分-灰色關聯度分析法

由于主成分分析與灰色關聯法各有其局限性，故考慮將二者聯合使用，集合兩種方法的優點從而發掘出一種更為合理的評價策略，具體方法是先將所測得的各項原始指標進行主成分分析，剔除掉冗余信息，再選取主成分中各序列的最高值作為參照序列進行灰色關聯度分析，由關聯度大小得出最終耐鹽性排名。

1.5 數據統計分析

應用Excel 2010整理試驗數據，并進行熵權法、灰色關聯度分析相關計算，利用SPSS 26.0 進行Pearson相關性分析、聚類分析和主成分分析，采用Origin 2018進行折線圖繪制。

2 結果

2.1 等權灰色關聯度法

將參考品種與4個鹽濃度下3種柳樹的15項耐鹽指標表現看成一個灰色關聯系統，根據灰色關聯度分析原則，關聯度的大小表明了各參試品種與參考品種的接近程度，排序越靠前的品種綜合性狀越好。

由表1綜合樣本等權關聯度值(0.528，0.529)可以看出，A34與A42兩個品種具有相似的耐鹽優勢，而A7品種與之差距較大，在不同濃度鹽脅迫下對3個柳樹品種進行耐鹽性比較，A42在20、80 mmol/L NaCl濃度下耐鹽能力優于其他兩個品種，A34和A7則分別在40、60 mmol/L處具有最佳耐鹽性，結合綜合樣本排序，3個柳樹品種耐鹽性由強到弱排序為A42、A34、A7。

表1 供試品種柳樹幼苗等權和熵權灰色關聯度及其排序Table 1 Equal weight and entropy weight grey relational grade and order of varieties tested of willow seedlings

2.2 熵權灰色關聯度法

熵值法計算指標權重時，若某個指標中的各個數值變化不大，則該指標在綜合分析中起的作用小，即權重小，相反則權重大[17]。不同柳樹品種在不同鹽濃度下的單個指標變化幅度不盡相同，這就為采用熵理論確定指標權重系數提供了合理依據。根據熵理論確定的各指標權重(OSID附表3)通過降位排序，前三位分別為CAT活性、APX活性及相對含水率，權重值均在0.1以上，這說明，CAT與APX活性、相對含水率3個指標對所選3個柳樹品種幼苗的耐鹽能力影響最大，可作為首要的耐鹽性鑒定指標，游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量影響次之，可作為重要的抗鹽適應性代表性狀。

由表1中熵權灰色關聯度分析排名可以得出與等權分析相似的結論，從綜合樣本排名來看A42稍低于A34，關聯值接近且大于A7，分別在4個鹽濃度中評價位次與等權關聯度相同，A42在低(20 mmol/L)、高(80 mmol/L)濃度中具有更好的耐鹽性，而A34與A7在中等濃度中表現更好。結合綜合樣本3個柳樹品種耐鹽性排序為A34、A42、A7。綜上所述，等權灰色關聯度與熵權灰色關聯度所得排名結果差異很小。

2.3 主成分分析法

由Person相關性分析(OSID附表4)可知，15個測試指標之間相關關系達到顯著水平的有 11 對，達到極顯著水平的有7 對，其中CAT活性、APX活性與可溶性蛋白含量兩兩之間呈極顯著正相關，游離脯氨酸含量與根冠比呈極顯著正相關、與可溶性蛋白含量呈極顯著負相關。

由于許多指標間都具有相關性或顯著相關性，為避免數據分析過程中信息疊加影響耐鹽性的鑒定結果。利用主成分分析對這些變量進行降維處理，將原本15個互有關聯的單項指標轉化為相互獨立的5個綜合指標，前5個主成分特征值均大于1，貢獻率分別為 28.818%、25.343%、17.945%、9.813%、8.155%，累積貢獻率達到了90.074%(表2)，大于85%。該5個綜合指標可以解釋原變量的絕大多數變異，因此能夠代替原來15個指標對NaCl脅迫下3個柳樹品種的耐鹽性評價。由表2主成分分析成分矩陣可以看出，游離脯氨酸含量、POD活性、根冠比、可溶性蛋白含量在主成分1中占有較大載荷，主成分2主要代表了相對電導率、凈光合速率、CAT及APX活性，主成分3主要包含MDA和可溶性糖含量，主成分4、5分別為相對含水率和H2O2含量。通過得分系數矩陣(OSID附表5)計算出各主成分因子的分值，前5個主成分的方差貢獻率通過歸一法處理，得出各自權重(OSID附表6)。根據公式(3)計算出各柳樹幼苗抗鹽能力的大小并進行綜合排序，得分越高，表明該濃度下柳樹品種鹽抗能力越強。

D=∑λjμ，

(3)

式中D為綜合得分值，λj為主成分權重，μ為柳樹品種主成分因子得分，j為1～5。

表2 主成分因子載荷矩陣及其特征值和貢獻率 Table 2 Principal component factor load matrix and its eigenvalue and contribution rate

注：AVE代表綜合樣本，20、40、60、80分別代表 20、 40、 60、 80 mmol/L NaCl 脅迫處理。圖1 各樣本主成分得分、灰色關聯-主成分得分及其排名Fig.1 Principal component score, grey correlation-principal component score and ranking of all the samples

從圖1(a)綜合樣本得分可以得出主成分分析法耐鹽性排序為A42、A34、A7，與等權灰色關聯法結論相同，但具體到各個鹽濃度下差別較大， A42在中低鹽濃度(20、40 mmol/L)下表現最好，而A34則在中高濃度下具有最好的抗鹽適應性(60、80 mmol/L)，且隨著NaCl濃度的逐漸升高，A34品種依然能保持較為穩定的耐鹽性。A7在各濃度下均排名靠后，與綜合樣本排名相符。

2.4 主成分-灰色關聯度分析法

以主成分分析法所得數據為基礎，選取5個主成分的最優值的作為參照序列X0=(2.342， 1.416， 1.152， 1.948， 2.441)，再運用灰色關聯度法最終得到3個柳樹品種鹽抗指標的主成分-灰色關聯分析結果。從圖1(b)可以看出，主成分-灰色關聯度分析法的綜合樣本排名結果與等權灰色關聯和主成分分析法相同，3個柳樹品種耐鹽性排序為A42、A34、A7，再分別從各鹽濃度來看，A42在20、60 mmol/L濃度下具有最好耐鹽性，A34在80 mmol/L下耐鹽性最佳，A7在40 mmol/L下表現好于A34、A42。整體來說，與主成分分析結果相比，基于主成分-灰色關聯度法的評價結果變動不大，在個別鹽濃度下排序有小幅度變化。

2.5 耐鹽性指標聚類分析

采用組間連接法對柳樹幼苗的測定指標進行R型聚類分析，建立了聚類樹狀圖(圖2)。采用Pearson相關系數作為距離測度方法，在距離為20處將所測全部15項指標劃分為4大類，因其同聚為一類的性狀指標間具有密切相關性，為避免信息重復可結合熵值權重系數以及主成分分析，在各聚類組中分別挑選代表性狀作為柳樹幼苗時期耐鹽性的鑒定指標。

圖2 15個耐鹽性指標聚類樹狀圖Fig.2 Clustering tree of fifteen salt tolerance indexes

3 討論

3.1 評價方法分析

對比等權灰色關聯與熵權灰色關聯法，3個柳樹品種在單獨各濃度下的耐鹽性排序完全一致，只有綜合樣本排名次序稍有不同，但也極為接近，僅僅是兩個相鄰的名次互換。所以可以得出結論，本文中權重分配對灰色關聯分析排名影響不大，但從理論上，熵權灰色關聯法更具合理性，可在后續試驗中再行驗證。

由于灰色關聯法不能排除指標間的重復信息，隨著指標數的增加數據重復度也會相應增加，不僅加大了計算量也會干擾分析結果，影響柳樹品種實際耐鹽性評價的準確度。主成分分析法可以將大量具有相關性的原始數據轉化為少數幾個互相獨立的綜合指標，較處理前的數據具有一定優越性，使得評價結果更加科學、合理、準確。本文通過主成分分析確定了5個主成分，其累積貢獻率達到 90%以上。由不同指標的主成分得分系數計算出各樣本主成分得分，最后再根據方差貢獻率對3個品種柳樹幼苗進行耐鹽性綜合評價，評價結果與前兩種方法有一定差異性，尤其體現在40、60 mmol/L NaCl濃度A34及A7品種的排名上，呈現截然相反的結果，這應該是由于灰色關聯法與主成分分析法間基本運算方式及賦權方法的不同造成的。

雖然主成分分析法能夠解決信息重疊的問題，但由主成分得分系數矩陣(OSID附表5)可以看出系數較大的項的正負各異，使得主成分歸類困難。但是每個主成分得分(OSID附表5)的縱向數據具有可比性[18]，故選取各樣本主成分因子的得分最大值作為理想序列，通過比較各樣本的主成分因子得分與理想序列的幾何相似程度來對各樣本進行排序，即計算灰色關聯度的過程。借此可以充分融合這兩種方法的優勢，克服單一方法的缺陷。由最終結果來看，A7品種在40 mmol/L濃度下雖然排名高于A34、A42，但3個品種的得分值差距很小，整體排名順次相鄰，可看作是具有相似耐鹽性，更加符合綜合耐鹽性排名，即A42，A34，A7。不考慮人為及環境因素所造成的數據誤差，一般來說植物耐鹽性隨著鹽濃度的變化應具有一定的連續性，在一定鹽濃度范圍內呈負相關或先上升后下降趨勢。而等權、熵權灰色關聯法得出的植株在不同鹽濃度下的耐鹽能力呈跳躍性，相比而言，主成分-灰色關聯分析法得出的評價次序則更加合理。

3.2 耐鹽指標選擇

植物耐鹽性是涉及多項性狀的綜合性表現，但針對不同生長發育時期的不同品種，篩選出與該物種耐鹽性能關聯度較高的少數幾項指標為評價參考，可以極大地節約選育成本，減少人力物力的付出。例如Feng等[19]研究表明種子萌發、葉片光合能力、表皮蠟質負荷和根系Na+外排能力等形態學和生理指標可作為評價柳樹耐鹽性的指標；Huang等[20]指出滲透脅迫指數、耐鹽指數和根系鈉和鉀含量比值似乎是最好的評價標準，因為這三項指標在柳樹種內及種間具有顯著差異性，可將各柳樹品種進行較好的耐鹽性區分和排序，且具有低成本、高效的優勢。

柳樹幼苗的耐鹽指標與耐鹽性之間的關系較為復雜，本文通過熵權法及主成分分析法初步確定眾多抗鹽指標中哪些能代表植物的抗鹽能力。研究結果表明：熵理論權重值前五位分別為CAT活性、APX活性、相對含水率、游離脯氨酸含量和可溶性蛋白含量，說明在鹽度脅迫下，柳樹幼苗對以上5個指標反映較為敏感，能夠迅速增加其含量或提高活性來抵御和適應外界的鹽脅迫環境；相關性分析表明，在15個測試指標之間共有18對指標呈顯著或極顯著相關，因此簡單分析柳樹耐鹽性時其中一個指標可以在一定程度上反映其他指標的信息，例如具有極顯著正相關性的CAT活性、APX活性與可溶性蛋白含量，便可選取其中一項作為耐鹽性鑒定指標；由主成分分析成分矩陣來看，在前五個主成分中占有較大載荷的幾組性狀與柳樹幼苗抗鹽能力密切相關，同時它們之間又相互制約相互聯系，在柳樹植株生理調節機制中占有重要地位。綜合三種分析方法和指標間的4項聚類，同時考慮數據的易獲得性，可選取葉片可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、H2O2含量及相對含水率作為柳樹苗期耐鹽性主要鑒定指標。

3.3 耐鹽性綜合評價

灰色關聯度分析法和主成分分析法均能綜合分析各指標的整體效應，從而客觀全面地反映不同鹽濃度條件下柳樹品種耐鹽能力大小。但是四種方法運算方式各不相同，且有三種不同的指標賦權方法，因此導致整體排名產生差距。本試驗結果也表明，有部分處理組(40、60 mmol/L)應用不同評價方法在耐鹽性評價上存在較大差異，綜合四種分析方法排名情況，在0～80 mmol/L NaCl濃度范圍內A34與A42耐鹽能力均優于A7。

4 結論

本文以三個新品種柳樹幼苗為材料，基于4個NaCl濃度脅迫下的15項生長生理指標數據，采用等權灰色關聯度分析、熵權灰色關聯度分析、主成分分析和主成分-灰色關聯度分析四種分析方法對柳樹幼苗的耐鹽能力進行了評價。綜合各評價方法可得出結論：三種柳樹幼苗中A42與A34均具有較好的鹽脅迫適應能力，A7稍差，其中A42在各個濃度中均表現出良好的鹽抗特性，A34則偏向于中高濃度耐鹽性更優異穩定，A7品種僅在中等鹽度下表現與A34、A42相同水平的耐鹽性，故而在耐鹽柳樹樹種的選擇中，可將無絮柳1號、濕地柳1號作為優良種質資源應用到鹽堿土地植被綠化的實踐中；本文在對比多種評價方法的同時創新性地融合主成分和灰色關聯度兩種分析方法，從品種和鹽濃度兩個方面挖掘信息，最終結果表明，相較于其他三種分析方法，主成分灰色關聯度法更具合理和代表性，可作為柳樹幼苗時期耐鹽性綜合評價的備選方法之一；葉片可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、H2O2含量及相對含水率可作為柳樹苗期耐鹽性主要鑒定指標。