黃芪中毛蕊異黃酮不同劑量對腦缺血再灌注大鼠神經細胞的保護作用*

河北中醫學院/河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室

張彐寧 靳曉飛 張 怡 周曉紅 高維娟(石家莊 050091)

提要 目的：研究黃芪中毛蕊異黃酮不同劑量對腦缺血再灌注(CIR)大鼠神經細胞損傷的影響，為臨床治療提供用藥依據。方法：將SPF級雄性SD大鼠50只，隨機分為：假手術組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，在體模擬CIR損傷環境。利用神經功能學評分(Zea Longa)法初步觀察CIR損傷后大鼠神經功能表現；鹽酸2,3,5-三苯基四氮(TTC)染色檢測腦梗死體積；尼氏染色觀察尼氏體變化；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表達。結果：與假手術組對比，模型組神經功能缺損癥狀明顯(P<0.05)，腦梗死體積明顯增大(P<0.05)，尼氏體明顯減少(P<0.05)，凋亡蛋白Caspase-3的表達明顯增加(P<0.05)，與模型組對比，給予不同劑量毛蕊異黃酮處理后，可見大鼠神經功能障礙明顯改善，腦梗死體積明顯減少(P<0.05)；尼氏體明顯增多(P<0.05)；凋亡蛋白Caspase-3表達明顯降低(P<0.05)；并且在以上檢測指標中，以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著。結論：黃芪中的毛蕊異黃酮可改善CIR損傷大鼠神經功能障礙，減小腦梗死體積，發揮神經保護作用，而毛蕊異黃酮高劑量組作用更為突出。

腦缺血再灌注(CIR)損傷是指腦缺血一定時間恢復血液供應后，其功能不但未能恢復，卻出現了更加嚴重的局部腦組織及其功能受損[1]。CIR損傷是缺血性腦卒中的重要并發癥。如何有效減輕再灌注造成的傷害，成為臨床和科研領域研究的重點。近年來隨著醫學領域的發展，人們對CIR損傷的發生機制不斷深入探索，并且在CIR損傷的治療過程中愈加重視中醫中藥的防治作用。補陽還五湯是益氣活血法的代表方，又是治療缺血性腦卒中的常用方，此方證以氣虛為本，血瘀為標，治以補氣為主，活血通絡為輔，方中重用生黃芪為君藥，補益元氣，意在氣旺則血行，瘀去絡通，在治療氣虛血瘀型中風中收到顯著療效[2]。現代藥理學研究證實，黃芪主要活性成分包括黃芪黃酮、黃芪多糖、黃芪皂苷三大類，毛蕊異黃酮作為黃芪黃酮類主要活性成分，具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒等作用[3]。本課題組前期在細胞水平觀察了毛蕊異黃酮對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞(PC12細胞系是來源于成年大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的細胞系)的影響，結果發現毛蕊異黃酮可顯著提高PC12細胞活性，減輕PC12細胞損傷，發揮保護作用[4]。本研究意在動物水平探討毛蕊異黃酮是否具有減輕大鼠CIR注損傷的作用。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，SPF級，5周齡，50只，雄性，體質量260～280 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2 試劑 毛蕊異黃酮購自上海士峰生物科技有限公司，純度≥98%，批號：18060411；線栓法大鼠腦缺血再灌注模型(MCAO)栓線(250～280 g)購自北京西濃科技有限公司(批號：2636-A3)；鹽酸2，3，5-三苯基四氮(TTC)染液(批號：T8877)購自美國Sigma公司；半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)單克隆抗體(批號：9662S)購自美國CST公司；BCA 蛋白測定試劑盒(批號：PC0020)購自北京索萊寶科技有限公司；甲苯胺藍染液(批號：20170227)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 多功能成像系統購自Vilber公司；LI-360型電熱恒溫培養箱購自上海龍躍儀器設備有限公司；Axio Observer 7型全自動倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；EG1150H型組織包埋機、RM2255型切片機購自德國Leica公司。

2 方法

2.1 實驗分組與模型制備 SD大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、毛蕊異黃酮低、中、高劑量組(5、10、20 mg/kg)。采用改良線栓法建立CIR損傷模型：SD大鼠適應性飼養7 d，術前禁食6～8 h，麻醉大鼠采用腹腔注射4%的戊巴比妥鈉，使大鼠呈仰臥位固定于動物手術臺上，常規頸部備皮消毒，頸部正中切口，玻璃分針鈍性分離、暴露頸總、頸內、頸外動脈，結扎并離斷頸外動脈，使線栓由頸外經頸總動脈插入到頸內動脈約(18±1)mm處，阻塞大腦中動脈2 h，即缺血2 h，之后緩慢拔出線栓，使頸內動脈和大腦中動脈恢復血流，即再灌注開始，再灌注24 h后，根據神經功能學評分(Zea Longa)標準：在術后24 h及術后蘇醒后進行觀察評分，0分，無神經系統缺損癥狀；1 分，不能完全伸展病灶對側前爪；2分，行走向病灶對側轉圈；3分，行走困難，向病灶對側傾倒；4分，不能自發行走，意識喪失；5分，大鼠死亡。0分、4分和5分者剔除，1分、2分、3分者為造模成功，列為實驗對象。假手術組線栓只插入到頸內動脈，而不進入大腦中動脈。給藥組在再灌注的同時給予腹腔注射不同劑量(5、10、20 mg/kg)的毛蕊異黃酮處理，腹腔注射給藥體積為8 mL/kg，假手術組和模型組等體積腹腔注射生理鹽水。

2.2 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積 各組大鼠造模給藥完成后，斷頭取材，將完整腦組織放入腦槽內置于-20 ℃冰箱，冷凍18 min，做冠狀位切片，每片腦組織厚度約2 mm，置于2% TTC染液中，放入37 ℃電熱恒溫培養箱避光孵育30 min，15 min時翻動1次，取出腦切片，按順序依次擺放，拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析圖片并計算腦梗死體積百分比(%)。

2.3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值 各組大鼠斷頭取材，做厚度約4 mm冠狀切片，進行組織固定、包埋，切片脫蠟至水，加入1%甲苯胺藍置于55～60 ℃電熱恒溫培養箱避光孵育30 min，蒸餾水沖洗，鹽酸酒精分化，無水乙醇脫水，二甲苯中透明5 min，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并計算尼氏體平均吸光度值。

2.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠Caspase-3蛋白表達 各組大鼠造模給藥處理后，斷頭取材，每組大鼠選取右側大腦中動脈供血區腦組織50 mg，進行組織研磨裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白濕轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入Caspase-3抗體4 ℃過夜，等滲緩沖鹽溶液(TBST)清洗3次，室溫孵育相應二抗1 h，TBST洗去二抗，將PVDF膜置于配制好的ECL化學發光液內，凝膠成像系統掃描成像，采用Image J軟件分析，計算目的條帶/對應內參的相對表達水平。

3 結果

3.1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經功能學評分結果 假手術組無神經系統缺損癥狀，評分為0；與假手術組相比，模型組出現明顯的神經功能損傷(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組神經功能損傷癥狀明顯減輕(P<0.05)，其中高劑量組最為顯著。詳見表1。

表1 Zea Longa法檢測各組大鼠神經 功能學評分結果

3.2 各組大鼠腦梗死體積的變化 TTC染色結果顯示：假手術組腦梗死體積為0，未見梗死灶，其它各組均有不同程度的腦梗死灶形成。與假手術組相比，模型組大鼠可見明顯的梗死灶，TTC染色白色缺血區明顯，有明顯的梗死灶形成(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組腦梗死體積均有所減小，其中高劑量組最為顯著(P<0.05)。見圖1、表2。

注：A，假手術組；B，模型組；C，毛蕊異黃酮低劑量組；D，毛蕊異黃酮中劑量組；E，毛蕊異黃酮高劑量組。圖1 TTC染色結果

表1 TTC染色檢測各組大鼠腦梗死體積結果

3.3 各組大鼠尼氏體的變化 尼氏染色顯示：假手術組尼氏體豐富，細胞排列整齊，并且細胞形態規則，輪廓清晰，神經細胞數量較多。與假手術組相比，模型組細胞數量較少，細胞皺縮，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，并且平均吸光度值明顯降低 (P<0.05) 。與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組細胞狀態明顯好轉，尼氏體增多，尼氏體平均吸光度值明顯增加，并且毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖2、表3。

注：A，假手術組；B，模型組；C，毛蕊異黃酮低劑量組；D，毛蕊異黃酮中劑量組；E，毛蕊異黃酮高劑量組。圖2 尼氏染色結果

表3 尼氏染色檢測各組大鼠尼氏體平均吸光度值結果

3.4 各組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達的變化 Western blot檢測結果顯示：與假手術組相比，模型組凋亡蛋白Caspase-3的表達明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，毛蕊異黃酮中、高劑量組Caspase-3的表達明顯降低，且以毛蕊異黃酮高劑量組更為顯著(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測結果

表4 Western blot檢測各組大鼠Caspase-3相對表達量結果

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05;與低劑量組比較，△P<0.05。

4 討論

腦缺血再灌注(CIR)損傷可造成腦功能嚴重受損，當腦組織由缺血低灌注轉變為再灌注時，腦細胞生物電發生改變，產生病理性慢波，伴隨著缺血再灌注的發生，病理性慢波持續并加重，出現一系列病理生理改變[5]。主要涉及的病理生理機制包括：炎癥反應、鈣離子超載、自由基過量生成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞凋亡與自噬等[6-9]。細胞凋亡在CIR病理進程中扮演了重要角色，隨著缺血再灌注損傷時間越長，腦組織超微結構開始發生明顯改變：線粒體腫脹，鈣離子沉積，線粒體嵴斷裂、胞核固縮、染色質凝集或邊緣化、內質網高度腫脹、尼氏體完整性破壞或消失、細胞結構明顯破壞，最終導致神經細胞凋亡[10]。CIR引起的神經細胞死亡方式主要以細胞凋亡為主，發生的部位主要在缺血病灶中心區周圍的半暗帶區域，而缺血半暗帶區常作為臨床上治療CIR損傷的治療基礎。因此，有效抑制細胞凋亡對于減輕CIR損傷具有重要意義。

細胞凋亡(apoptosis)是指生物體為維持自身內環境穩定，由嚴格基因調控的細胞自主性有序死亡過程。當細胞接收到凋亡信號刺激后，凋亡調控分子間相互作用，產生一系列復雜的生化反應，誘導蛋白水解酶(caspase)活化，從而裂解關鍵的細胞基質，導致細胞程序性死亡[11]。在此過程中，Bcl-2蛋白(B淋巴細胞瘤-2基因)家族的促凋亡蛋白Bax(Bcl-2-associated X蛋白質)發生寡聚化并向線粒體外膜聚集，從而改變線粒體膜通透性，使細胞色素c等促凋亡分子由線粒體膜間隙釋放入細胞質，激活內在的凋亡級聯反應，導致Caspase-3激活，最終誘導細胞凋亡[12]。Caspase-3蛋白在細胞凋亡程序中是最主要的終末剪切酶，在包括神經元在內的許多細胞類型中充當凋亡的執行者[13]，抑制Caspase-3活化，可阻止細胞凋亡的發生[14]，在細胞凋亡機制的研究中常作為重要參考指標。

中藥黃芪是臨床常用補氣要藥，始載于《神農本草經》，具有補氣活血化瘀之功效。中醫理論中氣與血之間有著緊密的聯系，“氣為血之帥”“血為氣之母”“氣能生血”“氣能行血”“氣行則血行”等理論更是闡述了氣血之間的具體關系，在缺血性腦中風的治療過程中，常以黃芪配伍成方，治療中風之氣虛血瘀證。補陽還五湯即為治療氣虛血瘀型中風的代表方劑，在臨床上應用至今，并取得顯著療效[15-16]。現代藥理學研究發現，黃芪的主要活性成分包括黃酮、皂苷、多糖三大類成分[17]，在調控自噬、抗炎、抗氧化、促進干細胞增值、調節血壓、改善認知功能障礙等方面均發揮著重要作用。其中，黃芪黃酮類成分更是受到越來越多的關注，毛蕊異黃酮是黃酮類的主要活性成分之一，亦是檢測黃芪質量的重要參考指標，在抗氧化、促進細胞增殖、延緩衰老、抗炎、抗心肌肥厚等方面均有應用，本課題組前期利用PC12細胞，在細胞水平研究發現，毛蕊異黃酮具有抑制缺氧缺糖/復氧復糖PC12細胞凋亡的作用[18]，但其在動物水平是否同樣具有抑制神經細胞凋亡，減輕CIR損傷作用，亟需探索。

因此，本研究通過建立大腦中動脈閉塞模型，模擬CIR損傷環境，在動物水平，觀察了不同劑量毛蕊異黃酮對CIR大鼠的神經保護作用，并初步探討了毛蕊異黃酮拮抗CIR損傷的作用機制。實驗結果發現， 模型組大鼠神經功能缺損癥狀明顯，腦梗死體積明顯增大，尼氏體明顯減少，凋亡蛋白Caspase-3表達明顯增多。當給予毛蕊異黃酮處理后，CIR大鼠神經功能障礙明顯改善，腦梗死體積明顯減少，尼氏體染色加深明顯增多，凋亡關鍵蛋白Caspase-3表達明顯降低。以上實驗結果表明：毛蕊異黃酮可減輕CIR損傷，其分子機制與毛蕊異黃酮調控凋亡關鍵蛋白Caspase-3表達密切相關。