基于HPLC指紋圖譜研究和多成分含量測定的尖葉假龍膽藥材的質量評價研究*

河北中醫學院

張 闖 劉衛哲 董倩波△ 劉興超 楊洪霞 孫佳歡 李 斯 李愛英(石家莊 050091)

提要 目的：建立尖葉假龍膽高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜并同時測定其中8種成分含量測定方法。方法：本方法采用HPLC，色譜柱為Waters XBridge C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長為254 nm，同時測定18批尖葉假龍膽組指紋圖譜及8種成分含量。結果：18批尖葉假龍膽指紋圖譜相似度大于0.990，標定了20個共有峰并測定了8種成分含量。結論：多成分含量測定方法以及指紋圖譜方法準確、穩定、重復性好，可為尖葉假龍膽質量控制標準的建立提供依據。

中藥指紋圖譜可以體現藥材中已知成分或未知成分的分布情況，具有整體性、特征性等特點，能夠較為全面地反映中藥所含化學成分的相對關系，同時提供豐富的鑒別信息，真正全面地表征藥材內在質量[19-21]。

本實驗建立尖葉假龍膽高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜，同時測定尖葉假龍膽中8種活性成分的含量，以期完善尖葉假龍膽的質量控制標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)、UV-9000紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)、SQP型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、Milli-Q超純水機(美國密理博公司)。

1.2 試劑 龍膽苦苷(批號：J0316AS)、芒果苷(批號：N0213AS)對照品購自大連美侖生物技術有限公司，異牡荊素(批號：No.524B021)、木犀草素(批號：4773-96-0)對照品購自北京索萊寶科技有限公司，去甲基雛菊葉龍膽酮(批號：Z08M8S30830)、雛菊葉龍膽酮(批號：Z10M8B30943)對照品，均購于南京元寶峰醫藥科技有限公司，去甲當藥醇苷和當藥醇苷由實驗室自制，各對照品質量分數均≥98%，可供含量測定用。乙腈(色譜純，Fisher公司)，超純水為實驗室Milli-Q超純水機自制。

1.3 藥材 藥材樣品于2014年至2019年在內蒙古、黑龍江、寧夏每年采集1次，共18批，經河北中醫學院藥學院中藥鑒定與炮制教研室鑒定為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽(Gentianellaacuta)，樣品信息詳見表1。

表1 尖葉假龍膽藥材樣品來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱( 250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫：0～10 min，5%～5%乙腈；10～20 min，5%～10%乙腈；20～30 min，10%～20%乙腈；30～ 35 min, 20%～30%乙腈；35～45 min，30%～50%乙腈；45～50 min，50%～60%乙腈；50～60 min，60%～60%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長254 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 供試品溶液的制備 取尖葉假龍膽樣品適量，精密稱取0.10 g，倒入50 mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇溶劑50 mL，超聲提取30 min，冷卻至室溫，搖勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取8種標準品適量，加入10 mL量瓶中，用甲醇配制質量分數分別為龍膽苦苷46.40 mg/L、芒果苷45.01 mg/L、去甲當藥醇苷15.03 mg/L、異牡荊素63.78 mg/L、當藥醇苷55.05 mg/L、木犀草素41.26 mg/L、去甲基雛菊葉龍膽酮36.30 mg/L和雛菊葉龍膽酮38.80 mg/L混合對照品溶液，搖勻，放于4 ℃冰箱中保存，以備使用。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 精密度試驗：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，以分離度較好且峰面積較大的雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計算各共有峰相對保留時間的RSD<2.21%，相對峰面積的RSD<1.78%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，并按“2.1”項下色譜條件連續進樣，記錄6份尖葉假龍膽樣品色譜圖，以雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間的RSD<2.15%，相對峰面積的RSD<1.89%，表明本方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗：取尖葉假龍膽供試品溶液(S1)，分別在制備后的0、2、4、8、12、24、48 h按“2.1”項下色譜條件進樣，以雛菊葉龍膽酮色譜峰峰面積為參照，計算相對保留時間的RSD<2.07%，相對峰面積的RSD<1.66%，說明供試品溶液在48 h內穩定。

2.4.4 尖葉假龍膽指紋圖譜的建立及相似度評價：取收集的18批尖葉假龍膽，按“2.2”項下樣品處理方法制備尖葉假龍膽供試品溶液(S1～S18)，并按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測。將所得18批樣品的色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A版)”進行分析，以S1為參照圖譜，多點校正后進行自動匹配，用中位數法生成對照指紋圖譜，得到尖葉假龍膽指紋圖譜共有模式及對照指紋圖譜，結果見圖1。經匹配后標定了尖葉假龍膽樣品指紋圖譜中20個共有峰，各共有峰相對保留時間的RSD<2.0%，以生成的尖葉假龍膽對照指紋圖譜為參照，對18批尖葉假龍膽色譜圖進行相似度評價，S1～S18相似度均≥0.990。

圖1 18批尖葉假龍膽的HPLC指紋圖譜疊加圖

2.4.5 指紋圖譜共有峰的指認與歸屬：通過與混合對照品比對，確定20個共有峰中，4號峰為龍膽苦苷，5號峰為芒果苷，8號峰為去甲當藥醇苷，10號峰為異牡荊素，13號峰為當藥醇苷，15號峰為木犀草素，17號峰為去甲基雛菊葉龍膽酮，20號峰為雛菊葉龍膽酮，混合對照品及尖葉假龍膽樣品的HPLC色譜圖見圖1。

2.5 尖葉假龍膽中8種成分含量測定

2.5.1 色譜條件及供試品溶液、混合對照品溶液的制備：同“2.1”“2.2”“2.3”項下方法。尖葉假龍膽8種混合對照品與藥材色譜圖見圖2。

注：1.龍膽苦苷;2.芒果苷;3.去甲當藥醇苷;4.異牡荊素;5.當藥醇;6.木犀草素;7.去甲基雛菊葉龍膽酮;8.雛菊葉龍膽酮。圖2 尖葉假龍膽混合對照品(A)和尖葉假龍膽樣品(B)的HPLC色譜圖

2.5.2 線性關系考察：按“2.3”項下方法制備的龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的混合對照品溶液，作為標準曲線最高質量濃度。按照倍比稀釋法，制備不同質量濃度的混合對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行測定。分別以龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得到8種對照品的回歸方程和相關系數，結果詳見表2。結果表明龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮在相應的質量濃度范圍內與峰面積的線性關系良好。

表2 8種成分線性關系考察結果 (mg/L)

2.5.3 精密度試驗：取尖葉假龍膽供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮面積的RSD值分別為0.12%、0.45%、1.37%、0.91%、1.46%、0.83%、0.51%、0.79%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗：取同一批尖葉假龍膽供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件連續進樣，計算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮質量分數的RSD值分別為0.77%、1.01%、0.88%、1.83%、0.59%、1.40%、0.91%、1.20%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗：取尖葉假龍膽供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24、48 h進樣測定，計算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮峰面積的RSD值分別為0.45%、0.62%、1.20%、1.52%、0.62%、1.37%、0.79%、1.07%，結果表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗：取同一批尖葉假龍膽樣品(S1)0.1 g，精密稱定6份，置100 mL量瓶中，分別加入各對照品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算得到龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的平均加樣回收率分別為101.42%、100.66%、101.26%、101.74%、100.59%、99.37%、101.32%、99.90%，RSD值分別為0.93%、0.76%、1.33%、2.36%、1.26%、1.74%、0.84%、1.16%，表明該方法的準確度良好。

2.5.7 樣品測定：制備18批尖葉假龍膽樣品的供試品溶液(S1～S18)，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品中8種成分的含量，結果詳見表3。18批尖葉假龍膽中，龍膽苦苷、芒果苷、去甲當藥醇苷、異牡荊素、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮的質量分數分別為1.45～1.68、1.14～1.27、12.88～13.75、0.10～0.13、9.84～10.42、0.44～0.56、12.58～13.03 、15.80～16.98 mg/g，其中去甲當藥醇苷、當藥醇苷、去甲基雛菊葉龍膽酮和雛菊葉龍膽酮含量較高，異牡荊素和木犀草素含量較少。

表3 18批尖葉假龍膽藥材中8種成分含量 (mg/g, n=3)

3 討論

綜上，本研究采用HPLC法建立了尖葉假龍膽指紋圖譜，并同時測定8種成分的含量。該方法簡便、準確，有效地反映了尖葉假龍膽的定性特征和定量信息，為其全面質量控制提供了方法。