茶樹種子貯藏及提高活力方法研究

林瑾 鄭鵬 陳玉春 劉少群 孫彬妹

摘要：茶樹種子播種對農業生產有重大意義，而茶樹種子保存對播種具有重要作用。茶樹種子在通過品質檢驗、活性檢測后，結合合理的貯藏方法可實現長期保存且仍具有較高的活力遺傳性和發芽率。文章總結了有關茶樹種子活力鑒定、貯藏特性、發芽率及其影響因素等方面的問題，探討茶樹種子品質檢驗標準、貯藏條件和貯藏方法，以期為今后茶樹種子保存、繁育等有關研究工作提供理論參考。

關鍵詞：茶樹;種子;保存;活力;成活率

Study on Methods of Storage and Vigor

Enhancement of Tea Seeds

LIN Jin1， ZHENG Peng1， CHEN Yuchun2， LIU Shaoqun1， SUN Binmei1*

1. South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2. Chaozhou Tianxia Tea Industry Co.， Ltd.， Chaozhou 521000， China

Abstract： Tea seed sowing is of great significance to agricultural production， while tea seed preservation plays an important role in sowing. After passing the quality test and activity detection， tea seeds combined with reasonable storage method can achieve long-term preservation and still have high vitality heritability and germination rate. This paper included the vitality identification， storage characteristics， germination rate and influencing factors of tea seeds， and discussed the quality inspection standards， storage conditions and storage methods of tea seeds， in order to provide a theoretical reference for the related research work of tea seed preservation and breeding in the future.

Keywords： tea plant， seed， storage， vigor， survival percent

茶樹種子對干燥脫水極為敏感，屬于典型的頑拗型種子[1]。茶樹種子含水率高達20%～60%，成熟茶樹種子長時間干燥脫水時，其生命活力會迅速下降。目前，對茶樹種子脫水方面的研究主要集中在生理生化和細胞學等領域[2]。Chen等[3]研究表明，對茶樹種子進行材料的脫水處理，增強低溫耐性后，仍能在接近0 ℃的低溫下保存數月，也能在液氮中保存下來。但是茶樹種子不耐脫水且易受低溫影響，一般在未達到低溫保存的理想狀態時就因對低溫的敏感性而失活。因此，降低茶樹種子對低溫的敏感性是當前研究長期保存茶樹種子的重要工作之一。在超低溫下，細胞物質代謝和生命活動幾乎停止，在這個機制中，Normah等[4]曾采用液氮方法保存頑拗型種子，郭長根等[5]也在液氮中保存頑拗型茶樹種子獲得成功。這些試驗證明液氮保存技術具有“無限期”保存頑拗型種子的可能，初步實現了長期保存茶樹種子的預想。試驗證明，在不同成熟階段中，成熟中期的茶樹種子最耐脫水，更易保存[6]。因此，在貯藏種子前，應選成熟中期的茶樹種子，并進行品質檢驗。在貯藏茶樹種子期間，應適時檢測其活力以獲取保存過程種子活力變化趨勢。

1 ?茶樹種子品質檢驗標準

茶樹種子采收后，應先根據標準進行品質檢驗，挑選優質種子進行保存，亦可節省貯藏空間。茶樹種子的品質標準為：夾雜物不超過2%、直徑不小于12 mm、千粒質量不低于1 000 g、含水率在22%～38%之間、發芽率不低于75%[7]。

2 ?茶樹種子活力檢測方法

在貯藏之前，可采用茚三酮溶液顯色法或TTc定量法（表1）測定茶樹種子活力，通過檢測活力來及時反映茶樹種子在長期保存下遇到的問題，并做出合理改進。

茚三酮溶液顯色法可定量檢測種子浸提液的氨基酸含量[8]，徐祥美[9]通過測定氨基酸茚三酮溶液的吸收峰以及測試氨基酸與茚三酮形成的藍紫色復合物的穩定性，來說明種子的氨基酸外滲量可反映出種子的品質及衰老程度。沈永等[10]也設計出價廉、快速、重現性好的茚三酮試紙法，該方法能夠反映種子播種價值，并半定量檢測種子活力。TTc定量法是測定種子脫氫酶活性快速而簡便的方法，脫氫酶活性與種子活力密切相關，脫氫酶活性高則種子活力高[8]。胡晉[11]通過改進TTc定量法省去了研磨、定容、離心等過程，大大簡化了操作步驟，并減少了三苯基甲臜（TTcH）的損失和氧化，提高了種子活力檢測的精確度。

3 ?茶樹種子貯藏特性

3.1 ?易受干燥損傷，對低溫敏感、易發生冷害

干燥脫水會降低茶樹種子細胞中水介質的流動性，產生代謝脅迫，細胞失去膨脹甚至發生萎縮，引起機械應力，阻礙細胞膜相對流動，進而降低脂肪酸的不飽和度。當茶樹種子在-25 ℃及以下的環境中長時間保存，極易造成細胞因產生冰晶而對其結構造成破壞性損害[6]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

3.2 ?微生物生長旺盛，呼吸作用強

頑拗型種子的臨界水分大多在30%以上，為微生物的生長提供了充足的水分。當種子含水率增加、貯藏溫度升高時，其代謝能力增強，呼吸作用也進而加強。

3.3 ?貯藏期間易發芽

在貯藏期間，種子在水分充足的情況下，易發芽。

4 ?茶樹種子發芽率及其影響因素

4.1 ?茶樹種子發芽率

種子在無任何貯藏措施的情況下，隨著貯藏時間的延長，半年后發芽率會迅速下降到20%左右[12]。郭長根等[5]采用鋁箔-薄膜復合袋密封包裝，將含水率為13.8%的種子直接投入液氮中貯藏，經118 d貯存后發芽率仍高達93.3%[13]，證明在適宜的貯藏條件下，種子長時間貯藏仍有較高發芽率。

茶樹種子發芽率可使用溫砂法測定，任取茶樹種子100粒，溫水浸泡3～4 h后，放入鋪有細沙的發芽盤中，上覆1層細沙，加少量水將沙濕潤，在25～30 ℃溫度下處理1～7 d，觀察發芽茶樹種子數量，計算發芽率。

4.2 ?形成茶樹種子活力的內因

夏春華等[14]對茶樹種子活力的研究結果表明，新鮮收獲的茶樹種子含有大量水分（約40%），茶樹種子的貯藏物質主要有脂肪、蛋白質和淀粉（脂肪和淀粉為種子生命活動提供能量，而蛋白質決定新陳代謝類型和個體發育方向）。這些貯藏材料是保持種子活力的必要條件，也是保持種子活力的基礎。種子活力是由多個基因控制的數量性狀，近年來，種子活力相關基因的QTL定位及其遺傳機制方面的研究取得較大進展，如已實現相關基因的克隆，馬娟等[15]研究表明種子活力具有高遺傳性等。在貯藏過程中，隨著呼吸作用的加強，茶樹種子貯藏物質逐漸消耗，造成種子活力降低，因此貯藏的前提便是抑制呼吸作用，保持種子的高活力。

4.3 ?茶樹種子發芽條件

茶樹種子發芽條件包括適宜的溫度、充足的水分和氧氣等。種子中有機和無機物質的分解需要酶的催化，酶需要在一定溫度下進行催化;當種子的水分充足，種皮會軟化和膨脹，進而氧氣進入并加強呼吸;氧氣充足時細胞的呼吸才會加強，酶的活動才會旺盛。

5 ?茶樹種子貯藏條件

5.1 ?控制水分

控制水分有兩種方式，一是使種子的含水率高于致死臨界含水率，如短期貯藏方法——將去果皮的茶樹種子用濕沙法貯藏2個多月[16]、吸脹貯藏、水浸貯藏;二是降低種子臨界含水率，如超低溫保存中快速脫水法——使茶樹種子短時間內降低含水率，減少因水分脅迫造成的細胞損害。

5.2 ?適宜低溫

短期貯藏：在-196 ℃液氮中保存。

一般貯藏溫度：對種子進行材料處理后（干燥至水分含量10%以下）可在0～5 ℃條件下密封貯藏。

6 ?茶樹種子貯藏方法

在短時間內播種或運輸的茶樹種子，可將其放置于陰涼干燥的室內，厚度不應超過15 cm，上方覆蓋少許草料，每7～8 d翻動1次，使種子失水均勻。如需次年春季種植，應合理貯藏，以免影響發芽率[17]。有以下4種簡單實用的茶樹種子貯藏方法。

6.1 ?沙藏法

沙藏法適合小規模貯藏，屬室內貯藏法。低溫（5～7 ℃）沙藏，一定的含水率和含氧量維持正常生命活動的條件下，種子進入被迫休眠狀態，但種皮的通透性增加，可提高種子的發芽率。

選通風干燥的室內，在地面鋪1層5～10 cm厚含水率50%的細沙，上面鋪10 cm厚的茶樹種子，再鋪5～10 cm厚含水率為50%的細沙，以此類推，堆高至30 cm即可。貯藏期間及時抽檢與適量灑水，若茶樹種子發生霉變應及時攤晾干燥。

6.2 ?溝藏法

溝藏法適合大規模茶樹種子的貯藏，工程量大，屬室外貯藏法。溝藏法在維持茶樹種子所需的貯藏溫度下，保證一定的濕度和二氧化碳濃度，以此減少自然損耗、抑制呼吸代謝、延長種子貯藏壽命。

在室外緩坡地，挖寬1 m、深30 cm的儲藏溝，先在底部鋪5～10 cm厚的蒲草或者細沙，倒入茶樹種子，上面蓋1層5～10 cm厚的蒲草，最后用泥土制作70 cm高屋脊形，間隔插入通氣竹筒。其間需要及時檢查種子是否發生霉變。

6.3 ?畦藏法

畦藏法適合大規模茶樹種子的貯藏。

選擇地勢平坦、土壤干燥且排水條件好的地塊做高畦，寬2 m、高18 cm，長度根據茶樹種子的多少和地形的長短來確定。畦面做好后，鋪1層2～3 cm厚的細沙，細沙上鋪1層6～7 cm厚的茶樹種子，茶樹種子上再鋪1薄層細沙，以茶樹種子不露出沙面為度，如此相間重復鋪完2～3層茶樹種子后，再鋪1層細沙，最后覆蓋干土密封成龜背形[18]。

6.4 ?超低溫保存

超低溫-196 ℃液氮保存是將茶樹種子自然干燥至含水率8%～10%，再以低溫使其代謝降低，細胞、組織和器官在低溫保存過程中不會發生遺傳變異和性狀變化。

每處理20粒種子后，用鋁箔復合袋密封，直接放入液氮罐冷藏。2個月后取出，在38～40 ℃溫水中迅速解凍恢復，然后用溫沙法測定發芽率。

但是，如果生物體細胞內的水分在冷卻過程中結冰，就會對細胞結構造成損傷和破壞，最終導致細胞死亡。因此，在液氮中保存（-196 ℃）以快凍快解的方法可以基本阻止水在頑拗型種子細胞內凍結，避免致命的冰凍傷害[19]，Song等[20]報道，快速降溫至-30～-15 ℃短時間內保存可避免茶樹種子內部細胞結構遭到損壞，因此，超低溫保存中降溫的速度是保持茶樹種子活力的關鍵因素之一。

談及低溫冷凍保存，一般認為胚是最好的冷凍保存材料，因為胚是植物的雛形，包含了大部分的遺傳信息。因此，大多數頑拗型種子都是在胚（或下胚軸）的成熟期時在超低溫下貯藏，而且材料越新鮮，效果越好。郭長根等[5]用液氮保存茶樹種子，并獲得顯著的效果。此外，添加冷凍保護劑可防止冷凍和脫水過程中種子細胞結構的破壞，減少脅迫相關的自由基調節的損害[21]。40337452-CF39-4E08-A258-AE78B6224B83

茶樹種子的超低溫長期保存，材料的處理和選擇都至關重要，比如以降低冰晶損傷的玻璃化法，卻因茶樹種子個頭大，不利于玻璃化所需的脫水速率，所以不適用于茶樹種子保存。因此，在今后的科研工作中，應對茶樹種子的最佳保存部位和保存方式進行探索分析。

7 ?結論與展望

我國茶樹育種研究的重要內容之一是利用優異種質資源培育新品種[22]，其中最經濟、安全和高效的種質資源保存方式是種子保存。種子的含水率和貯藏溫度對種質資源保存的影響格外重要。目前生產上所采用的各種貯藏方式，還不是十分理想，未能達到最大限度保持種子生活力的目的，有不少茶樹種子都在貯藏中失去活力，從而造成損失[23]。

因此，即使不少研究表明超低溫貯藏即液氮貯藏法是有望長期保存茶樹種子的方法，但也還需深度研究其他貯藏方法，比如氣調法、隔水浸泡法等，開拓更多種子保存方法的研究，改善貯藏種子的條件，加強對保存種子的管理。

水分是種子萌發的關鍵觸發因素，但種子感知水分的機制仍未解決。Dorone等[24]發現了一個未鑒定的擬南芥朊蛋白，命名為FLOE1，該蛋白在水合過程中發生相分離，使胚能夠感知水分脅迫，可證明FLOE1縮合物的生物物理狀態調節了其在體內抑制不利環境下種子萌發的生物學功能。因此，可以設想通過種子萌發試驗，證明FLOE1在水分脅迫條件下可降低種子的萌發以長期保存種子。

我國很早就開始進行了茶樹種質的組織培養，上個世紀已成功應用于農業、林業和醫學類等相關領域，產生了巨大的經濟效益和社會效益。將不同的品種進行誘導植株，不斷地培養，從而形成科學穩定的系統，并能夠在一般環境下很好地遺傳，將這種方法應用于茶樹種子的保護和儲存，是目前發展的趨勢[25]，該技術也在不斷地創新優化中變得更加成熟。

茶樹種子的貯藏包裝方式方法，也是現如今應積極研究解決的問題。世界主要產茶國在茶樹種子方面做了大量工作，并取得了一些成果，科研工作者更應汲取經驗，研究開發茶樹種子長期保存更有效的方法，提高我國農業科技進步水平。

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