野生紅菇菌分離純化及其抑制病原真菌作用研究

穆燕， 趙文君， 艾鑫， 律鳳霞

(牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157012)

紅菇(RussulalepidaFr.)屬擔子菌綱、傘菌目、紅菇科，秋季林下群生或單生的菌根真菌。廣泛分布于我國各林地。子實體含有5種多糖、28種脂肪酸，富含蛋白質和倍半萜等活性物質。味甘性溫，長期食用可益壽延年，有滋陰補虛、清涼解毒、抑抗腫瘤的功效，少數有毒[1-2]。紅菇較高的食藥用價值倍受食用者和學者們的關注和研究，而紅菇的季節(jié)性出菇和人工栽培的低產特性限制了其價值應用。有學者研究及報道證實，許多大型真菌具有天然的抑病菌效果，既能提供食藥用成份[3-4]，也可替代抑菌防腐的化學藥劑，達到植物病害生物防治的目的[5-6]。實驗分離純化野生紅菇菌絲體，對其代謝物質抑制植物病原真菌的作用進行了初步研究，探討紅菇菌絲體在植物病害防治中的應用價值[7]，為彌補紅菇子實體季節(jié)性缺失提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

紅菇菇蕾：秋季野生蘑菇生長季節(jié)林下采集。

真菌DNA 提取試劑盒：QIAGEN公司產品；

PCR Mix試劑盒：寶生物有限公司產品；

水稻稻瘟菌：牡丹江師范學院微生物實驗室提供。

其他常用試劑：國產分析純。

1.2 試驗儀器及培養(yǎng)基

分析天平；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；自動高溫蒸汽滅菌鍋；超凈工作臺；PCR擴增儀；恒溫水浴鍋等。

孟加拉紅培養(yǎng)基(分離純化時使用抑細菌)：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂(無水)0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.03 g、氯霉素0.1 g(乙醇溶解后加入)，定容至1000 mL，分裝后滅菌備用。

PDA培養(yǎng)基(抑菌培養(yǎng)時使用)：200 g去皮馬鈴薯(加水煮沸10 min取濾液)、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、定容至1000 mL，分裝后滅菌備用。

2 試驗方法

2.1 野生紅菇菇蕾(子實體)采集及組織分離

組織法分離菌絲[8-10]：野外采集的紅菇菇蕾帶回實驗室，無菌環(huán)境下75%酒精快速清洗菇體表面，徒手掰開菌蓋，無菌刀割取內部菌肉組織，接種至孟加拉紅培養(yǎng)基平板中，恒溫(26 ℃)倒置暗培養(yǎng)，隨時觀察菌絲生長及是否污染，多次轉接篩選菌落單一無污染的培養(yǎng)平板。

2.2 紅菇菌絲體與子實體遺傳同一性鑒定

菌落單一無污染的分離培養(yǎng)物繼續(xù)暗培養(yǎng)至菌膜形成，分別提取子實體和菌膜DNA， 以真菌ITS通識引物對DNA進行PCR擴增，擴增體系及反應條件如表1。

表1 PCR反應體系及反應條件

PCR產物經瓊脂糖凝膠(1%)電泳，目的條帶清晰的PCR產物外送測序，測序結果經NCBI網站BLAST比對，確定所測序列的種屬并驗證菌絲體和子實體序列是否同一[11-12]。

2.3 紅菇代謝液制備及pH值測定

分離純菌絲體轉接至液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)(26 ℃，150 r/min)，10 d后每隔2 d無菌條件下取培養(yǎng)液測pH值，直到培養(yǎng)液pH值趨于恒定(約20 d)，培養(yǎng)液無菌條件過濾備用。

2.4 紅菇與水稻稻瘟菌的抑菌實驗

對峙培養(yǎng)：用記號筆將無菌培養(yǎng)皿(直徑9 cm)底皿在直徑上平分三段標記兩個三分點，無菌條件下倒PDA培養(yǎng)基平板，凝固后在兩個標記點對應接種紅菇和水稻稻瘟菌，兩菌塊相距3 cm；重復三板。封口膜封邊后倒置恒溫(26 ℃)暗培養(yǎng)，待兩個菌落生長到彼此接觸后，觀察菌落形態(tài)及菌絲間的拮抗及抑制效果。

添加紅菇代謝液培養(yǎng)水稻稻瘟菌：將紅菇代謝液(2.2制備)按0 %、25 %、50 %、75%、100 %的濃度梯度添加到常規(guī)PDA培養(yǎng)基中，分別接種已活化的稻瘟病菌，三個重復，封口膜封邊恒溫暗培養(yǎng)，待稻瘟病菌明顯萌發(fā)后，每隔5 d測量稻瘟病菌菌落生長直徑，計算抑菌率。

3 結果與分析

3.1 紅菇子實體形態(tài)特征初鑒別

野生紅菇子實體中等大小，菌蓋中部色深紅至暗(黑)紅，邊緣紅色較淡，菌肉白色，菌蓋表面覆少許鱗片，菌柄長柱或稍彎曲，纖維質，符合紅菇子實體表型特征(如圖1)。

圖1 野生紅菇子實體

3.2 紅菇組織分離培養(yǎng)

多次轉板分離的菌絲體在孟加拉紅培養(yǎng)基中呈現白色致密菌絲(如圖2)。

圖2 紅菇組織分離培養(yǎng)物

3.3 紅菇分離菌液體培養(yǎng)

紅菇純化菌恒溫振蕩液體培養(yǎng)15d后得到大小均勻的白色菌球，代謝液清澈，菌球清晰可見(如圖3)，pH值恒定為3.44，無菌過濾得清澈濾液。

圖3 紅菇分離菌液體培養(yǎng)

3.4 紅菇子實體及菌絲體DNA分子鑒定

分離菌菌膜與子實體同時提取DNA，以真菌ITS通識引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖電泳分離(如圖4)。

圖4 DNA的PCR(真菌通識引物)產物電泳圖

圖5 PCR產物序列BLAST比對結果

1-2泳道：子實體DNA；3-4泳道：菌絲體DNA 見：子實體和菌絲體DNA的PCR產物在約700bp處出現目的條帶，測序后比對子實體和菌絲體PCR產物序列相同；測序序列經網站Nucleotide BLAST比對，與網站公布MK532813.1同源性達100%，確定采集的子實體和分離的純培養(yǎng)物為東北紅菇[9](如圖4)。

3.5 紅菇對水稻稻瘟菌的抑菌效果

平板對峙培養(yǎng)如圖6-a所示：三組稻瘟菌菌絲生長空間極小，即紅菇菌株對稻瘟菌生長的抑制效果顯著，且明顯降解并阻抑了稻瘟菌黑色素分泌。

a為紅菇與稻瘟菌對峙試驗；b為紅菇代謝液對稻瘟菌抑制試驗

紅菇代謝液pH值恒定至3.44后無明顯變化，不同比例添加至PDA固體培養(yǎng)基接種稻瘟菌。圖6-b顯示：紅菇代謝液對稻瘟菌絲生長有抑制作用但差異不顯著(表2)，而表現明顯的是添加代謝液的稻瘟菌均表現為氣生菌絲量增加，其原理及生產應用價值有待后續(xù)研究驗證；從培養(yǎng)皿背面圖可見：添加紅菇代謝液的稻瘟菌黑色素分泌均受顯著抑制，大于75 %添加量時對稻瘟菌黑色素分泌表現完全抑制效果。

表2 添加代謝液培養(yǎng)稻瘟菌菌落直徑及差異分析

4 結論

無需特殊培養(yǎng)條件，紅菇子實體經組織分離可獲得遺傳一致的菌絲體及代謝液，紅菇菌株對水稻稻瘟菌有顯著的拮抗及抑制作用，其代謝液對稻溫菌的生長量抑制不顯著，但可阻隔其黑色素分泌，而產生黑色素的植物病原真菌，其黑色素是侵染植物的必要條件，紅菇代謝液對不同致病菌抑菌效果的差異可通過提高添加濃度和純度進一步進行研究，但其產生酸性代謝液是其抑菌的主要物質基礎。因此紅菇及其代謝液在水稻稻瘟病生長防治有研究應用價值。菌絲體的培養(yǎng)彌補了子實體季節(jié)性生長的限制，為野生紅菇的生物防治價值的研究應用奠定基礎。