高通量測序技術分析鴨皮中耐熱菌群

海丹，喬明武，宋蓮軍，沈玥，孟靜南，黃現青

摘? 要：鴨皮作為肉制品中常用的添加原料，其微生物在不同熱殺菌處理狀態下的多樣性研究非常重要。將鴨皮分別在60、70、80、90、100、110、120 ℃條件下熱處理后25 ℃恒溫放置1 周，通過高通量測序分析鴨皮的微生物多樣性情況。結果表明：60 ℃熱處理的鴨皮中主要菌屬為假單胞菌屬（33.52%）和不動桿菌屬（18.55%），70 ℃熱處理的鴨皮中主要菌屬為不動桿菌屬（18.46%）、狹義厭氧梭菌屬18（12.41%）、變形桿菌屬（11.04%）、假單胞菌屬（10.17%）、狹義厭氧梭菌屬7（8.62%），80、90 ℃熱處理的鴨皮中優勢菌屬為狹義厭氧梭菌屬18，相對豐度分別為63.04%和84.11%，100 ℃熱處理組優勢菌屬為芽孢桿菌屬（49.50%）、狹義厭氧梭菌屬18（29.19%）和厭氧桿菌屬（17.20%），110 ℃熱處理組優勢菌屬為芽孢桿菌屬（99.23%），120 ℃熱處理組優勢菌屬為狹義厭氧梭菌屬18（52.41%）、芽孢桿菌屬（33.07%）和狹義厭氧梭菌屬7（12.23%）;樣品聚類和β-多樣性分析表明，溫度對鴨皮中的細菌群落組成和豐度差異影響較大。

關鍵詞：鴨皮;細菌多樣性;高通量測序;熱處理溫度;優勢菌群

Analysis of Heat Resistant Bacteria in Duck Skin by High Throughput Sequencing

HAI Dan1，2， QIAO Mingwu1，2， SONG Lianjun1，2， SHEN Yue1，2， MENG Jingnan1， HUANG Xianqing1，2，3，4，*

（1.College of Food Science and Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou? ?450002， China; 2.Henan Engineering Technology Research Center of Food Processing and Circulation Safety Control， Zhengzhou? ?450002， China; 3.Henan Technology Innovation Center of Meat Processing and Research， Zhengzhou? ?450002， China; 4.Henan Engineering Research Center of Intelligent Meat Segmentation and Bioconversion， Zhengzhou? ?450002， China）

Abstract： As duck skin is commonly used a raw material for meat products， studying the microbial diversity in duck skin under different thermal sterilization conditions is vital. In the present study， duck skin was treated at 60， 70， 80， 90， 100， 110 or 120 ℃ and then stored at a constant temperature of 25 ℃ for one week. The microbial diversity of duck skin was investigated by high-throughput sequencing. Analysis of operational taxonomic units （OTUs） showed that the main bacterial genera in duck skin treated at 60 ℃ were Pseudomonas （33.52%） and Acinetobacter （18.55%）; and the main bacterial genera in duck skin treated at 70 ℃were Acinetobacter （18.46%）， Clostridium sensu stricto-18 （12.41%）， Proteus （11.04%） and Pseudomonas （10.17%）， and Clostridium-sensu-stricto-7 （8.62%）. Clostridium-sensu-stricto-18 （63.04% and 84.11% in relative abundance） were found to be dominant in duck skin treated at 80 and 90 ℃; Bacillus （49.50%）， Clostridium sensu-stricto-18 （29.19%） and Anaerosalibacter （17.20%） were dominant in duck skin treated at 100 ℃; the dominant bacteria in duck skin treated at 110 ℃ were Bacillus （99.23%）; the dominant bacteria in duck skin treated at 120 ℃ were Clostridium sensu stricto-18 （52.41%）， Bacillus （33.07%） and Clostridium sensu stricto-7 （12.23%）. Sample clustering and beta diversity analysis showed that temperature had a great influence on the differences in the bacterial community composition and abundance in duck skin.

Keywords： duck skin; bacterial diversity; high throughput sequencing; heat treatment temperature; dominant microflora

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024

中圖分類號：TS251.92? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ?文章編號：

引文格式：

海丹， 喬明武， 宋蓮軍， 等. 高通量測序技術分析鴨皮中耐熱菌群[J]. 肉類研究， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HAI Dan， QIAO Mingwu， SONG Lianjun， et al. Analysis of heat resistant bacteria in duck skin by high throughput sequencing[J]. Meat Research， 2022， 36（5）：? . DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220324-024.? ? http：//www.rlyj.net.cn

我國是肉制品生產大國，擁有悠久的肉制品加工歷史[1-3]。近些年來，隨著食品工業的迅速發展，家禽類成為僅次于豬肉的第二大類消費肉制品[4]。家禽主要有雞、鴨、鵝等，其中以雞鴨肉制品最為常見。鴨皮是肉鴨在屠宰過程的副產品，因其富含多種營養成分且可以改變肉制品的色澤、質地、口感等特性[5]而被應用于肉制品中[6]。然而，與發達國家相比，我國對家禽副產品的利用程度和方式比較單一，不同規模的企業對家禽副產品的利用程度和深度不盡相同[7-10]。我國對副產品的利用更多集中在血、毛、頭、爪、內臟、骨架等[11]，早期企業對于豬皮、鴨皮、雞皮的利用都集中在膠原蛋白的提取[12-13]，近年來，食品企業和相關學者加強了對畜禽皮的綜合開發利用，為開發新的、多樣化的火腿腸，迎合越來越多口味挑剔消費者的需要，伍佰鑫等[14]從湖南長沙某鴨肉加工廠采購宰后48 h的新鮮鴨胸肉和鴨皮，預先磨碎并均質化，添加到火腿腸中，發現鴨皮添加量為30%或40%的鴨火腿品質較優，有效改善了適口性。聶曉開[15]研究北京烤鴨的風味形成原理和西式火腿的成型工藝，使用鴨脯肉作為原料，在單獨烤制鴨皮形成烤鴨風味的基礎上，制備壓縮火腿。在我國，禽類的屠宰加工過程包括：掛禽→電擊暈→宰殺→瀝血→浸燙→脫毛→胴體體表檢查→摘嗉→凈毛→去頭→開膛→切爪→轉掛→掏臟→內臟檢驗→臟體分離（副產品）→副產品加工→預冷前檢驗→胴體高壓沖洗→預冷減菌→預冷后檢驗→分割[16]。預冷減菌階段是禽肉屠宰加工中微生物的關鍵控制點之一[16]，工廠生產過程中經預冷后能控制鴨肉等產品的微生物生長，在預冷階段鴨皮原料的微生物數量與后期鴨皮在熱處理階段的初始菌數量密切相關，降低鴨皮中所含的微生物種類及數量對肉制品的安全控制影響重大。

目前，熱處理仍是食品工業中常用的殺菌方法，根據其溫度的不同，可以分為低、中、高溫肉制品，其殺菌溫度范圍為60～120 ℃，溫度不同，殺菌效果不同。細菌種類不同，對熱的耐受程度也不同，導致不同熱處理的肉制品腐敗菌群也可能不同。高通量測序技術中因包含了聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）這一步驟，導致不能區分活/死細胞的DNA，從而導致不真實的多樣性或過高估計活細胞的數量。而疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）因其具有疊氮基團，在光照下能與死細胞的DNA分子發生共價交聯，從而抑制死細胞DNA分子擴增，且PMA不能進入活細胞，與活細胞DNA發生共價交聯?；谶@一優點，PMA分子被用于處理鴨皮在經過熱殺菌后死亡細菌的DNA，從而得到鴨皮中仍存活的細菌群落組成。這對添加熱殺菌鴨皮的肉制品殺菌工藝的選擇、可能致腐微生物的預防及預測有重要指導意義。因此，本研究通過高通量測序技術對不同熱殺菌后鴨皮耐熱微生物菌落情況進行分析研究，為企業安全使用鴨皮原料提供數據支撐。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料與試劑

新鮮的鴨皮取自河南安陽某肉制品企業，選用北京鴨。

NaCl? ?天津市江天化工技術有限公司;一步式DNA提取試劑盒? ?北京天恩澤基因科技有限公司;E.Z.N.A.?細菌基因組提取試劑盒? ?美國Omega Bio-Tek公司;熱啟動高保真DNA聚合酶試劑盒? ?北京全式金生物技術有限公司;EX Taq酶? ?日本TaKaRa公司;PMA? ?美國Biotium公司;二甲基亞砜? ?河南比根生物科技有限公司。

1.2? ?儀器與設備

CFX 96熒光定量PCR儀? ?美國Bio-Rad公司;FXB303-2電熱恒溫培養箱? ?上海樹立儀器儀表有限公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計、1300系列II級A2型生物安全柜? ?賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司;5430高速冷凍離心機? ?德國Eppendorf公司;ABI 9700 PCR儀? ?美國GeneAmp公司;DYY-6C電泳儀? ?北京六一儀器廠;Gel DocIt TS3紫外凝膠成像系統? ?美國UVP公司;SX-500全自動蒸汽滅菌鍋? ?日本Tomy公司;400CC拍擊式均質機? ?法國BagMixer公司;Qubit 2.0 Flurometer熒光光度計? ?上海Life Technologies公司;2100生物分析儀? ?美國安捷倫科技有限公司;MiSeq System高通量測序儀? ?美國Illumina公司。

1.3? ?方法

1.3.1? ?樣品制備及分組

通過無菌操作對鴨皮取樣，從25 kg鴨皮中隨機選擇24 份鴨皮樣品（每份25 g），分別置于無菌袋中并用橡皮帶密封，以未經熱處理（25 ℃）的樣品為對照組，其余樣品平分為7 組，每組3 個平行，分別置于60、70、80、90、100、110、120 ℃中進行水浴熱殺菌，使用針刺式肉品中心溫度計（量程50～300 ℃）直接刺在鴨皮上，當樣品的中心溫度達到對應溫度時，計時10 min。熱處理后的樣品放入25 ℃恒溫培養箱1 周，以實現活菌富集。樣品培養1 周后取出，向樣品中加入225 mL無菌生理鹽水，并在拍打式均質器中勻化120 s，取20 mL勻漿物17 226×g離心10 min收集細菌，棄去上清液，將收集的細菌溶解在500 μL無菌生理鹽水中備用。

1.3.2? ?PMA處理

將1 mg PMA溶于200 μL體積分數20%二甲基亞砜中，制備5 μg/μL的儲備溶液，并在-20 ℃下避光保存。使用時，將PMA儲備溶液稀釋10 倍，用作PMA工作溶液。使用透明的1.5 mL離心管，將10 μL PMA工作溶液加入到500 μL細菌溶液中，至終質量濃度為10 μg/mL。在黑暗中孵育5 min后，使用650 W鹵素光源將樣品曝光5 min。樣品管放置在離光源約20 cm處并水平放置在冰上（以避免過度加熱）。偶爾進行搖動以保證光照均勻。在光誘導交聯后，17 226×g離心10 min收集細菌。

1.3.3? ?細菌基因組DNA提取

熱殺菌組和未加熱組的鴨皮分別裝入無菌均質袋中，再加入225 mL滅菌生理鹽水后在拍打式均質器中勻化120 s，取20 mL勻漿物17 226×g離心10 min收集細菌。然后使用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA。

1.3.4? ?16S rDNA文庫制備

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品是否有降解和雜質，通過超微量分光光度計初步檢測DNA樣品純度，熒光光度計檢測DNA樣品濃度，檢驗合格的DNA（A260 nm/A230 nm大于1.2，質量濃度20 ng/μL）進行PCR擴增。PCR實驗采用熱啟動高保真DNA聚合酶，20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、FastPfu 聚合酶0.4 μL、牛血清白蛋白0.2 μL、模板DNA 10 ng，ddH2O補至20 μL。PCR擴增使用的引物為上游引物：341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）、下游引物：805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR反應參數：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸40 s，35 個循環;最后72 ℃延伸10 min。為確保擴增效率和準確性，使用EX Taq酶。擴增結束后對擴增的目的片段進行富集，然后加入1 μL特異Index序列，建庫流程如圖1所示。完整的文庫結構包含P5、i5Index（Index2）、i7Index（Index1）和P7，其中P5、P7接頭位于文庫兩端，Index是用于文庫混合測序時區分不同樣本的標簽，是測序文庫的唯一識別碼。

1.3.5? ?庫檢及測序

文庫構建完成后，先使用熒光光度計進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用生物分析儀對文庫的插入片段進行檢測，所插入片段符合預期后，使用熒光定量PCR儀及相關的熒光定量檢測試劑盒進行擴增，對文庫的有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。檢測合格的文庫采用HiSeq進行測序，測序模式、通量及質量選擇PE250模式。檢測合格的文庫，采用高通量測序儀進行測序。

1.3.6? ?數據過濾

測序得到的某些原始序列會含有測序接頭序列及低質量序列，為了保證信息分析數據的質量，對原始序列進行過濾，得到高質量的Clean Reads，用于后續分析。

1.3.7? ?序列拼接

對過濾后的序列，采用PEAR序列拼接算法將雙末端測序序列根據末尾的重疊情況合并成一條序列，再進行下一步分析。PEAR程序可以合并來自可變長度靶片段的原始Illumina雙端Reads。該程序評估了所有可能的雙端Reads重疊，不需要靶片段大小作為輸入，而且還通過統計檢驗減少假陽性概率。在模擬數據和實際數據上的測試顯示，PEAR可以高度準確地對雙端Reads進行合并。

1.3.8? ?數據處理

測序得到的序列，使用Flash和Trimmomatic軟件進行生物信息學分析，包括進行質量控制、去除前后引物和條形碼得到有效序列，然后使用Uparse軟件（vsesion 7.0，http：//drive5.com/uparse/）對有效序列在97%水平上進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類[17]。在QIIME平臺（http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html），采用RDP classifier（version 2.2，http：//sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析[18]，分別在門、屬水平統計各樣本的群落組成，與細菌16S rDNA數據庫Greengene（Release 13.5，http：//greengenes.secondgenome.com/）對比[19]。利用α-多樣性和β-多樣性對樣品菌群進行評價[20]。選取Shannon、Simpson、Ace、Chao 1指數和覆蓋率等指標進行α-多樣性分析，其中，Chao1指數和Ace指數反映群落豐富度，Shannon指數和Simpson指數反映群落多樣性。基于Bray-Curtis計算方法，采用主成分分析（principal components analysis，PCA）法和非度量多維尺度（non-metric multidimensional scaling，NMDS）分析法進行β-多樣性分析。Heatmap圖利用R語言Vegan算法計算得到，以顏色梯度表征二維矩陣或表格中的數據大小，并呈現群落物種組成信息[21]，每種處理3 個平行。通過SPSS 18.0軟件進行數據間差異顯著性分析。

2? ?結果與分析

2.1? ?不同熱殺菌處理鴨皮DNA序列長度分析

通過16S rDNA高通量測序，8 組樣本、24 份樣品總共得到1 572 454 條優質序列。對所有樣品的優質序列長度進行統計。由表1可知，序列長度多集中于430～450 bp，符合理論值。

2.2? ?不同熱處理條件下鴨皮表面微生物α-多樣性分析

由表2可知：不同熱處理溫度對鴨皮中細菌多樣性的影響較大，8 組樣本覆蓋率均達到99.9%以上，且不存在顯著性差異，這表明在當前測序量下能較好反映樣本細菌群落的豐富度和多樣性;Chao 1指數和Ace指數越高表明群落豐富度越高，60 ℃條件下熱處理的樣品具有最高的細菌群落豐富度，但與對照組和70 ℃處理的樣品之間不存在顯著性差異;Shannon指數越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數越大，說明群落多樣性越低。110 ℃條件下熱處理的樣品具有最低的Shannon指數和最高的Simpson指數，表明鴨皮中細菌群落的多樣性最低。α-多樣性分析結果顯示，60 ℃熱處理的鴨皮樣品中觀測到的物種數超過對照組，但不存在顯著性差異，110 ℃熱處理的鴨皮樣品中觀測到物種最少，但與120 ℃處理的樣品不存在顯著性差異。

2.3? ?不同熱處理條件下鴨皮表面微生物物種組成分析

由圖2可知，在熱處理的鴨皮樣品中發現的菌門絕大多數均為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。對照組的主要菌門為變形菌門（63.71%）和厚壁菌門（30.17%）;60 ℃熱處理組與對照組相比，變形菌門具有更高的相對豐度，高達75.92%，厚壁菌門的相對豐度為22.32%，與對照組相比略有下降;而70 ℃處理組與對照組相比，變形菌門的相對豐度下降，厚壁菌門的相對豐度上升，分別為53.71%和40.75%;當熱處理溫度大于70 ℃后，厚壁菌門成為最主要的菌門，80、90、100、110、120 ℃熱處理組相對豐度分別為97.32%、99.24%、97.86%、99.93%、99.97%）。

由圖3可知，當熱處理溫度低于80 ℃時，樣品中的優勢菌屬呈現一種較均勻的狀態，沒有絕對的優勢菌屬，均由幾種菌屬共同組成。如對照組中，優勢菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）（21.94%）、變形桿菌屬（Proteus）（20.99%），其次是漫游球菌屬（Vogococcus）（11.59%）;60 ℃處理組樣品的主要菌屬為假單胞菌屬（Pseudomonas）（33.52%）和不動桿菌屬（Acinetobacter）（18.55%），其次還有低豐度的變形桿菌屬（5.71%）和狹厭氧梭菌屬7（Clostridium sensu stricto 7）（6.32%）;70 ℃處理組樣品的優勢菌屬為不動桿菌屬（18.46%）、狹義的厭氧梭菌屬18（Clostridium sensu stricto 18）（12.41%）、變形桿菌屬（11.04%）、假單胞菌屬（10.17%）、狹義的厭氧梭菌屬7（8.62%）;80 ℃和90 ℃處理組的優勢菌屬為狹義厭氧梭菌屬18，相對豐度分別為63.04%和84.11%;100 ℃處理組的優勢菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus）（49.50%）、狹義厭氧梭菌屬18（29.19%）和厭氧桿菌屬（Anaerosalibacter）（17.20%）;110 ℃處理組的優勢菌屬為芽孢桿菌屬（99.23%）;120 ℃處理組的優勢菌屬為狹義厭氧梭菌屬18（52.41%）、芽孢桿菌屬（33.07%）和狹義厭氧梭菌屬7（12.23%）?？傮w來說，對照組及熱處理溫度低于80 ℃時，樣品中的主要菌屬較多樣，且沒有一種絕對優勢的菌屬;當熱處理溫度≥80 ℃后，樣品中的優勢菌屬開始傾向于產芽孢的菌屬，其中狹義厭氧梭菌屬18和芽孢桿菌屬最為突出。另外，厭氧桿菌屬是厭氧梭菌屬（Clostridium）的一個新屬，關于它的臨床研究尚較少。

2.4? ?不同熱處理條件下鴨皮表面微生物β-多樣性分析

為評估鴨皮的細菌群落結構與熱處理溫度之間的關系，采用PCA和NMDS多元統計方法分析8 組熱處理的鴨皮基于屬水平的群落結構差異。由圖4～5可知，前2 個主成分的累計貢獻率為89.94%，8 個熱處理組的鴨皮樣品主要分為2 組，其中對照組和60、70 ℃熱處理的鴨皮樣品聚集在一起，這表明60、70 ℃熱處理組的處理效果差別不大，80、90、100、110、120 ℃熱處理的樣品聚集在一起。

2.5? ?不同熱處理條件下鴨皮表面微生物的聚類分析

對樣品中相對豐度前20的菌屬進行聚類繪制熱圖。由圖6可知，對照組與60、70 ℃處理組樣品的優勢菌屬存在大部分交疊，表明這3 組鴨皮樣品中的細菌群落結構基本相似。而80、90、100、110、120 ℃處理組的優勢菌屬也存在交疊，主要集中在狹義厭氧梭菌18和芽孢桿菌屬2 種菌屬，這表明高于80 ℃熱處理的鴨皮中細菌群落結構有一定的相似性。

3? ?討? 論

本研究針對熱處理溫度對鴨皮中細菌多樣性的影響研究結果顯示，與對照組（25 ℃）相比，60、70 ℃熱處理對鴨皮微生物多樣性的影響較小，有研究表明，肉類產品熱加工過程中復雜介質的物理和化學成分對微生物的殺傷力有影響，其中脂肪對菌株的耐熱性起重要作用[23]。也有研究表明，低熔點脂肪在高于其熔點的溫度下由固相快速轉變為液相，在此期間它能吸收相當多的熱能，利用這種相變特性提高了加熱過程中益生菌的存活率[24]，這與本實驗的研究結果相一致，因此鴨皮所含有大量蛋白質、脂肪等營養物質[22]在60、70 ℃熱殺菌條件下對細菌具有保護作用，不能有效降低鴨皮的細菌多樣性。大多數食品加工通常在80～100 ℃的溫度下對成分進行熱處理，保持5～15 min[25]。在此過程中，大多數營養形式的微生物被滅活，但是不足以殺死細菌內生孢子[26]，因此本實驗也發現，當熱處理溫度≥80 ℃時，產芽孢的菌屬開始成為優勢菌屬。一般來說，食物中的孢子在110～130 ℃濕熱處理20～40 min可以滅活，有時對于高酸性或冷藏的食品，80～100 ℃下處理10 min也足以使孢子失活[27-28]。這也解釋了鴨皮在加熱到110～120 ℃時仍有許多細菌能夠繼續存活下來。盡管更高溫度的熱處理可有效滅活孢子，但也會對熱敏感食物造成不利影響[29]。因此，未來研究出能夠有效滅活孢子且對食品質量感官影響最小的處理方法至關重要[30]。

本研究觀察到了不同熱處理溫度對鴨皮中細菌群落組成及多樣性的影響，研究結果為添加鴨皮產品的肉制品企業在鴨皮原料安全控制、存貯條件選擇、殺菌參數確定、防腐劑復配選擇、產品流通條件選擇及產品腐敗安全風險控制等方面提供了理論依據。然而，本研究沒有評估其他環境因子對微生物多樣性的影響，這也導致高溫熱處理的鴨皮中仍能觀測到較多物種，沒法得到合理解釋，此部分在后續研究中需要改進。鴨皮作為添加原料成為脂肪等的替代品，能夠有效改善肉制品的色澤、質地、感官等質量指標，且其價格遠遠低于鮮肉，但由于復雜的環境因素，鴨皮中包含多種細菌，因此企業在使用鴨皮時仍需謹慎。企業選擇鴨皮原料的殺菌處理條件時應注意：1）過高的溫度不一定能夠很有效地除菌;2）最合適的殺菌溫度分別為鴨皮中心溫度90、110 ℃處理10 min;3）對于熱處理后鴨皮的細菌控制，除了加入廣譜抑菌劑外，還要著重關注芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬，選取有效的抑菌劑格外重要。

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