生菜中金黃色葡萄球菌生長模型的建立

瞿 洋,宇盛好,白亞龍,林 婷,周昌艷,索玉娟?

(1 上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海 201403;2上海市市場監督管理局信息應用研究中心,上海 200233)

在我國,由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的20%—25%,該菌是僅次于沙門氏菌和副溶血性弧菌的第三大食源性致病菌[1]。 金黃色葡萄球菌能產生耐高溫的腸毒素,由腸毒素引起的食物中毒表現有惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀[2-3]。 一般認為金黃色葡萄球菌濃度大于105CFU∕g(mL)時會產生腸毒素,進而引發食物中毒[4-6]。 因此,預測金黃色葡萄球菌在特定環境下的污染水平,對保證食品安全具有重要意義。

生菜是我國消費最多的一類即食蔬菜,近年來隨著人們對膳食營養需求的提升,其市場需求不斷擴大[7]。 由于高水分、多氣孔和易損傷等特點,生菜極易受到食源性致病菌的污染[8]。 2018—2019 年,美國因生菜污染食源性致病菌接連爆發了食物中毒疫情,患病人數累計277 人[9]。 為預防此類食物中毒的發生,國內外已先后開展了構建鮮切生菜中沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和細菌總數預測微生物模型的研究[10-15]。 目前,金黃色葡萄球菌在生菜中的生長行為尚不清楚(金黃色葡萄球菌現有研究多集中于肉制品、米面制品和乳制品中[16-18])。 國內外研究均顯示,金黃色葡萄球菌是生菜中常見的食源性致病菌[19-21]。 我國食品中致病菌限量標準GB 29921—2013 規定,即食果蔬制品中金黃色葡萄球菌的最大限量為103CFU∕g(mL)。

為評估生菜產品在生產加工、儲藏運輸等過程中金黃色葡萄球菌的生長變化情況,本研究對有利福平抗性的金黃色葡萄球菌分離株進行生長測定,比較修正的Gompertz(SGompertz)模型和修正的Logistic(Slogistic)模型對其在生菜中生長的擬合度,獲得其最大比生長速率和遲滯期。 在此基礎上,采用Huangrate 模型和二次多項式模型建立生菜中金黃色葡萄球菌的二級生長模型,以期為生菜在運輸及儲藏過程中的定量風險評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

奶油生菜購于上海市奉賢區南橋鎮超市和農貿市場;金黃色葡萄球菌為本單位自生菜中分離保存(經國標GB 4789.10—2010 分離鑒定和PCR 檢測該菌的特異基因nuc 證實為金黃色葡萄球菌)。

Baird-Parker 培養基(BP)、磷酸鹽緩沖液(PBS)為北京陸橋技術有限責任公司產品;胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)、瓊脂粉為英國Oxoid 公司產品;利福平(分析純)為美國Sigma 公司產品。

1.1.2 主要儀器設備

高壓滅菌鍋(SX-500),日本Tomy Digital Biology 公司;生物安全柜(1300 SERIES A2 型),美國Thermo公司;恒溫培養箱(Medcenter Einrichtungen GmbH 型),德國Friocell 公司;恒溫振蕩培養箱(TQZ-312 型),上海精宏實驗設備有限公司;電子天平(AL104),瑞士Mettler Toledo 公司;漩渦混勻儀(Vortex Genie 2),美國Scientific Industries 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株利福平抗性誘導

金黃色葡萄球菌生菜分離株接種于BHI 液體培養基,37 ℃搖床過夜培養,將其按照1∶100 接種于含利福平的BHI 液體培養基中進行耐受性誘導。 利福平質量濃度為0、5 mg∕L、10 mg∕L、20 mg∕L、40 mg∕L、80 mg∕L、100 mg∕L、120 mg∕L。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的接種、培養及計數

金黃色葡萄球菌分離株在BHI(含100 mg∕L 利福平)培養基中過夜培養至穩定期,經10 倍梯度稀釋至103CFU∕mL 制成接種液。 選取市場新鮮生菜樣品,制成鮮切生菜[22],具體做法為:去除外層葉片,風干,切成約4 cm×4 cm 大小,每份稱取約10 g 鮮切葉片置于均質袋中備用。 吸取1 mL 接種液于鮮切生菜上,分別置于15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃的恒溫恒濕培養箱中培養,每隔一段時間取出1 份樣品加入90 mL 無菌生理鹽水,采用平板計數測定菌落數[23]。 每個溫度進行3 組平行試驗,測定終點為金黃色葡萄球菌生長達到穩定期。

1.2.3 生菜中金黃色葡萄球菌一級生長模型的建立

修正的Gompertz(SGompertz)模型和修正的Logistic(Slogistic)模型[24]均為經典的一級生長模型,其中Slogistic 模型簡單方便,適用于環境簡單、食品成分單一的情況;SGompertz 模型采用雙指數函數,同時考慮了遲滯期對模型的影響,適用于適溫下致病菌的生長[25-26]。 本研究中生菜培養環境簡單,營養成分單一,葉片結構復雜,而金黃色葡萄球菌符合遲滯期生長規律,所以優先選用這兩種模型擬合生菜中金黃色葡萄球菌的生長,計算相應的最大比生長速率和遲滯期。

1.3 數據處理

采用Excel 2003 軟件進行數據處理,應用Origin 8.5 和IPMP 2013 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 菌株利福平抗性誘導

金黃色葡萄球菌生菜分離株在所有利福平篩選質量濃度(0、5 mg∕L、10 mg∕L、20 mg∕L、40 mg∕L、80 mg∕L、100 mg∕L、120 mg∕L)下生長良好(OD600>0.8),故本試驗金黃色葡萄球菌生菜分離株利福平最高耐受質量濃度為120 mg∕L。 生菜葉片上的背景菌在含有100 mg∕L 利福平的BP 平板上無明顯生長,為確保金黃色葡萄球菌利福平抗性的穩定,選用耐受100 mg∕L 的金黃色葡萄球菌誘導株進行后續試驗。

2.2 生菜中金黃色葡萄球菌生長的一級模型

選用SGompertz 和Slogistic 模型分別擬合15 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和40 ℃下金黃色葡萄球菌的生長曲線(圖1—5),其模型擬合參數見表1。 結果顯示,SGompertz 模型的R2值均優于Slogistic 模型,說明SGompertz 模型的擬合度較高;SGompertz 模型的RMSE 值均小于Slogistic 模型,說明SGompertz 模型的誤差較小。 R2值和RMSE 值結果均表明SGompertz 模型能更好地擬合不同溫度下金黃色葡萄球菌在生菜中的生長,因此本研究最終選擇SGompertz 模型作為金黃色葡萄球菌最適的一級生長模型(表2)。

圖1 15 ℃時生菜中金黃色葡萄球菌生長曲線的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.1 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 15 ℃

圖2 25 ℃時生菜中金黃色葡萄球菌生長曲線的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.2 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 25 ℃

圖3 30 ℃時生菜中金黃色葡萄球菌生長曲線的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.3 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 30 ℃

圖4 37 ℃時生菜中金黃色葡萄球菌生長曲線的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.4 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 37 ℃

圖5 40 ℃時生菜中金黃色葡萄球菌生長曲線的SGompertz 模型和Slogistic 模型Fig.5 SGompertz model and Slogistic model of growth curve of S.aureus in lettuce at 40 ℃

表1 生菜中金黃色葡萄球菌的一級生長模型擬合參數Table 1 Fitting parameters of primary growth model of S.aureus in lettuce

表2 生菜中金黃色葡萄球菌的最適一級生長模型Table 2 Optimal primary growth model of S.aureus in lettuce

表3 可以看出,溫度從15 ℃上升至37 ℃時,最大比生長速率從0.007 h-1上升到0.242 h-1,遲滯期從17.592 h 下降至1.827 h;當溫度達到40 ℃時,最大比生長速率降低至0.145 h-1,遲滯期變大至2.140 h。

表3 SGompertz 模型得到的不同溫度條件下的生長參數Table 3 Kinetic growth parameters estimated by SGompertz model at different temperatures

2.3 生菜中金黃色葡萄球菌二級生長模型的建立及評價

根據SGompertz 模型擬合得到金黃色葡萄球菌在不同溫度下的μmax和λ,選用Huang-rate 模型和二次多項式模型作為二級模型,對溫度與μmax、λ 的關系進行擬合(圖6)。 評價結果(表4)顯示,采用Huangrate 模型擬合的溫度與μmax關系的R2為0.978、Bf為1.011、Af為1.018,表明該生長預測模型的預測誤差[30]為1.77%。 采用二次多項式模型擬合的溫度與λ 關系的R2為0.956、Bf為1.004、Af為1.035,表明該生長預測模型的預測誤差為3.51%。 同時,從圖6 可以看出,金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中生長的最低溫度為14.958 ℃,最高溫度為40.193 ℃。

圖6 溫度與最大比生長速率μmax、遲滯期λ 的關系Fig.6 Relationship between temperature and specific growth rate or lag phase

表4 二級模型的評價Table 4 Various statistical characteristics of the secondary models

3 討論與結論

本試驗通過構建生菜中金黃色葡萄球菌的生長模型,獲得了該菌在生菜中的生長規律,為金黃色葡萄球菌在生長中的定量風險評估提供了依據。 本研究表明,14.9 ℃可有效抑制金黃色葡萄球菌的繁殖,建議生菜在該溫度及以下貯藏運輸。

本研究構建模型的材料有兩個特點:(1)試驗菌株為生菜分離株,與標準菌株相比,菌株異質性因素造成的模型偏差較小;(2)生菜未經清洗消毒處理,通過在目標菌中引入抗性標記,排除了計數過程中統計生菜樣品自身可能含有金黃色葡萄球菌的可能性,同時也還原了背景微生物對目標菌的生長可能存在協同或抑制作用[31],構建的模型更為真實客觀。

朱奚慕[12]比較了鮮切生菜中沙門氏菌生長的4 種一級生長模型,發現SGompertz 模型更適合描述該菌在10 ℃以上的生長,與本研究選用SGompertz 模型作為金黃色葡萄球菌最適的一級生長模型結果相符。 同時,本研究發現,金黃色葡萄球菌在生菜中的最大比生長速率隨著溫度的升高先升后降;遲滯期隨著溫度的升高先降后升,該趨勢與已有研究相符[32-34]。 該現象與微生物的細胞膜流動性有關,即溫度越高,微生物的細胞膜流動性越強,運輸營養物質越快,微生物不斷得到營養物質的補充,有利于微生物的生長[35]。 若生長溫度高至生菜出現變色、出水等變質現象時,營養物質的流失一定程度上阻礙了金黃色葡萄球菌的生長,相應地,最大比生長速率會降低,遲滯期會變大。

根據Ross[36]對偏差因子的劃分標準,Bf在0.9—1.05,越靠近1,模型越可靠。 Braun 等[37]認為,Af值在1.0—1.9,模型均可接受。 根據上述理論,本研究選用的兩種二級模型擬合度都較高。 后續可通過@RISK等軟件將模型帶入,計算運輸和貯藏時特定溫度下金黃色葡萄球菌在生菜中的污染水平,以掌握金黃色葡萄球菌在生菜中的生長規律,同時通過Spearman 等級分析獲得溫度、時間對污染水平的影響,為定量風險評估提供依據。

本研究顯示,金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中生長的最低溫度為14.958 ℃,與Park 等[28]和劉曉慧等[19]的研究相符,但與該菌在模擬蟹肉[38]、原料乳[29]、即食米飯[32]中的最低溫度(3.8 ℃、7.9 ℃、7.0 ℃)存在一定差異。 造成金黃色葡萄球在生菜中最低生長溫度與其他食品存在差異的原因可能有以下兩個方面:1)生菜葉脈、氣孔密度、葉片表面疏水性及可溶性蛋白均會導致細菌在葉片上的黏附差異[8];2)生菜基質本身具有的如水分活度、營養物質、pH 等條件會影響其攜帶的目標菌的生存狀態,從而影響金黃色葡萄球菌的生長[39]。

本研究中金黃色葡萄球菌在鮮切生菜中生長的最高溫度為40.193 ℃,與李文杰等[38]在模擬蟹肉中金黃色葡萄球菌的最高生長溫度(44.1 ℃)存在一定差異,原因主要有:(1)食品介質的差異;(2)理論上,模擬溫度越接近細菌生長最高溫度甚至高于最高溫度,計算得到的最高生長溫度值越準確。 由于生菜在40 ℃貯藏時出現了腐敗變質現象,故沒有在40 ℃以上取試驗點。

綜上,金黃色葡萄球菌在生菜中生長的二級模型為:μmax=0.021 ×(T -14.958)[1-e5.175(T-40.193)],λ=0.024 23T2-1.979 32T+42.124 97。 本研究也存在不足之處,即只進行了內部驗證,比較了模型預測值和實測值,后期可利用Combase 等數據庫的數據對二級模型進行評價及適當修正,使其更具普適應與說服力;另外,本研究構建的模型為恒溫生長模型,后期也可開展波動溫度下金黃色葡萄球菌在生菜中生長的研究。