外周血CCL26、CCR3表達與變應性鼻炎患者疾病嚴重程度的關系

熊洪斌，楊茜，石潤杰

1.上海市奉賢區奉城醫院耳鼻喉科，上海 201411；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院耳鼻喉科，上海 200011

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)又被稱為變態反應性鼻炎或過敏性鼻炎，是指患者接觸到的過敏物質與機體免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)抗體結合發生橋聯反應作用于鼻黏膜從而引起患者發生血管通透性增加、毛細血管擴張等過敏反應[1-2]。AR主要臨床癥狀為連續性或間歇性打噴嚏、流清水鼻涕、鼻塞、嗅覺暫時性減退等，雖然不會危及患者的生命安全，但嚴重影響患者的生活質量。目前，關于AR的診斷主要依賴于臨床癥狀評分，但可能存在患者過度描述臨床癥狀，無法準確判斷AR，因此，尋找與AR有關的生物標志物成為目前研究的熱點[3-4]。趨化因子配體26(chemokine C-C motif ligand 26，CCL26)又叫嗜酸性粒細胞趨化因子3(eosinophil chemotactic factor-3，eotaxin-3)，屬于CC家族重要成員之一。有研究表明，CCL26在炎癥反應、過敏反應等發揮重要作用[5]，其與CC趨化因子受體-3(C-C chemokine receptor-3，CCR3)結合后，特異性激活嗜酸性粒細胞向炎癥趨化，釋放組織胺等炎性介質從而參與炎癥反應和過敏性反應。CCR3是一種非特異性受體蛋白，除了作為CCL26的受體發揮作用之外，也可作為嗜酸性粒細胞趨化因子1(eosinophil chemotactic factor-1，eotaxin-1)、嗜酸性粒細胞趨化因子2(eosinophil chemotactic factor-2，eotaxin-2)等其他CC趨化因子的受體來發揮不同生物學功能[6]。本研究通過檢測AR患者CCL26、CCR3表達水平，探討其與AR疾病嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年1月在上海市奉賢區奉城醫院耳鼻喉科收治的86例AR患者作為研究對象(研究組)。納入標準：①符合《AR診斷和治療指南》中關于AR的診斷標準[7]；②入院前未接受抗組胺、免疫等治療；③知情同意并簽署同意書；④臨床資料完整。排除標準：①伴有肝臟、肺腎等重要器官疾病；②合并鼻竇炎、哮喘等過敏性疾病；③合并自身免疫性疾病；④合并精神疾病。86例患者中男性45例，女性41例；年齡24～57歲，平均(34.49±4.71)歲。根據《變應性鼻炎及其對哮喘的影響》中的分類標準[8]將所有AR患者分為輕度AR組(30例)、中度AR組(27例)和重度AR組(29例)。另選取同時期在我院保健科體檢的91例健康志愿者作為對照組，其中男性46例，女性45例；年齡22～53歲，平均(35.91±4.66)歲。評價所有受試者的過敏性鼻炎評分量表(Score for Allergic Rhinitis，SFAR)評分。研究組和對照組受檢者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。本研究經上海市奉賢區奉城醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 采集所有受試者空腹靜脈血4 mL，以3 000 r/min離心15 min后分離血清，并置于-80℃環境中保存待測。清晨空腹肘靜脈血置于乙二胺四乙酸抗凝管中，2 000 r/min離心15 min分離出血漿。

1.2.2 檢測外周血CCL26、CCR3表達水平 采用ELISA法測定各組受試者外周血CCL26的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，CCL26試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司。采用流式細胞分析儀檢測外周血CCR3相對表達量，首先加入CCR3-FITC(10 mL)試劑至指標試管中，隨后將血漿100 mL加入至試驗檢測試管中，設有同型號對照試管，搖勻后，25℃避光孵育20 min，隨后加入溶血素2 mL，25℃避光放置5 min，離心后(1 000 r/min離心5 min)丟掉上清液，加磷酸鹽緩沖溶液(PBS)2 mL，再一次離心丟掉上清液，添加300 mL PBS溶液，搖勻，采用流式細胞儀(型號：BD FACSCalibur)上機檢測分析外周血CCR3在血漿中的表達。流式細胞分析儀(型號：BD FACSCalibur)購自美國BD公司。

1.3 觀察指標 比較兩組受試者外周血CCL26、CCR3表達水平、不同臨床參數AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平以及不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平；分析AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平與SFAR評分的相關性；分析CCL26、CCR3對AR的診斷價值；分析影響AR的危險因素。

1.4 統計學方法 應用SPSS25.0統計軟件分析數據。計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平與SFAR評分的相關性采用Pearson相關分析法分析；CCL26、CCR3對AR的診斷價值采用受試者工作特征曲線(ROC)曲線分析；影響AR發生的危險因素采用多因素Logistic回歸分析。檢驗水準取α=0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組受試者的外周血的CCL26、CCR3表達水平比較 與對照組比較，研究組患者外周血CCL26、CCR3表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 兩組受試者的外周血CCL26、CCR3表達水平比較(±s)

表1 兩組受試者的外周血CCL26、CCR3表達水平比較(±s)

組別對照組研究組t值P值例數91 86 CCL26(ng/L)2.44±0.39 4.83±1.07 19.954 0.001 CCR3(%)20.41±5.39 40.63±9.25 17.887 0.001

2.2 不同臨床參數AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較 不同性別、年齡、變應原、癥狀發作時間的AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；IgE陽性者外周血CCL26、CCR3表達水平明顯低于IgE陰性者，SFAR＜7者外周血CCL26、CCR3表達水平明顯低于SFAR≥7者，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同臨床參數AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較(n=86,±s)

表2 不同臨床參數AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較(n=86,±s)

項目性別(例)男女年齡(歲)＜36≥36變應原季節性常年性有無癥狀發作時間間接性持續性IgE陽性陰性SFAR＜7≥7例數45 41 40 46 51 35 48 38 33 53 55 31 30 56 CCL26(ng/L)3.12±0.99 3.25±1.01 3.33±1.05 3.32±1.02 3.11±0.89 3.51±1.25 4.19±1.86 3.41±1.30 4.02±1.56 4.21±1.64 4.96±1.42 3.87±1.49 3.16±0.87 4.13±1.55 t值0.602 0.045 0.946 1.734 0.087 0.532 0.596 3.358 0.001 3.165 0.002 P值0.549 CCR3(%)41.52±8.31 40.91±9.04 39.69±8.07 40.12±8.81 40.32±8.97 41.01±9.11 41.98±9.64 33.21±8.99 42.35±8.91 42.12±8.77 50.94±9.98 42.56±9.74 35.44±8.78 49.96±9.67 t值0.326 0.235 0.815 0.348 0.729 0.118 0.907 3.771 0.001 6.847 0.001 P值0.745

2.3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較 與輕度AR組比較，中度AR組、重度AR組患者外周血CCL26、CCR3表達水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，與中度AR組比較，重度AR組患者外周血CCL26、CCR3表達水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較(±s)

表3 不同程度AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平比較(±s)

注：與輕度AR組比較，a P＜0.05；與中度AR組比較，b P＜0.05。

組別輕度AR組中度AR組重度AR組F值P值例數30 27 29 CCL26(ng/L)3.86±0.97 4.99±1.02a 5.69±1.23ab 21.616 0.001 CCR3(%)35.44±8.66 40.21±9.45a 46.38±9.68ab 10.326 0.001

2.4 AR患者外周血CCL26、CCR3表達水平與SFAR評分的相關性 經Pearson相關分析法分析結果顯示，CCL26、CCR3表達水平與SFAR評分均呈正相關(r=0.657、0.686，P＜0.01)，見圖1。

圖1 CCL26、CCR3與SFAR評分的相關性

2.5 CCL26、CCR3對AR發生的診斷價值 ROC曲線結果顯示，外周血CCL26診斷AR發生的ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.697(0.618～0.777)，敏感度為51.2%，特異性為87.9%，截斷值為2.914 ng/L；CCR3診斷AR發生的AUC為0.752(0.678～0.827)，敏感度為62.8%，特異性為84.6%，截斷值為31.197；兩者聯合檢測的AUC為0.833(0.769～0.897)，敏感度為73.3%，特異性為86.8%，見圖2。

圖2 ROC曲線

2.6 影響AR發生的危險因素 將是否患有AR作為因變量(未發生為0，發生為1)，以CCL26水平、CCR3表達水平作為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，外周血CCL26、CCR3表達水平是影響AR發生的獨立危險因素(P＜0.05)，見表4。

表4 影響AR發生的多因素Logistic回歸分析

3 討論

AR是耳鼻咽喉頭頸外科常見的非感染性炎性疾病之一。AR嚴重影響患者的正常生活和工作。世界上約有5億人罹患AR，占全人類的10%～20%[9]。有研究表明，我國19個一線城市的AR發病率為4%～38%，且呈上升趨勢[10]。目前AR的診斷主要依賴臨床癥狀評分，然而該方法存在主觀性，AR病情無法得以準確判斷，因此尋找客觀有效的生物學指標以評估AR病情成為當前研究的熱點[11-12]。

CCL26由77個氨基酸組成，能使炎癥細胞聚集，造成炎癥反應和過敏性反應。其主要通過與CCR3結合而發揮作用，兩者存在一定的協同作用。CCL26水平升高說明機體發生炎癥反應。研究表明，CCL26與遲發型變態反應有關，且可作為評估急、慢性炎癥嚴重程度的生物學指標[13]。劉鈺等[14]研究結果表明，急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)患者血清CCL26水平遠高于正常人，其表達水平隨ARDS病情的加重而升高，且ARDS死亡患者血清CCL26水平明顯高于存活患者。肖雷等[15]研究結果表明，支氣管哮喘急性期患兒血清CCL26水平明顯高于哮喘緩解期患兒，且其水平隨哮喘病情的加重而升高。本研究中，與對照組比較，研究組AR患者外周血CCL26水平明顯升高，隨AR病情的加重而升高。且Pearson相關分析法分析顯示AR患者外周血CCL26水平與SFAR評分呈正相關，與前述研究結果相近，提示CCL26的表達在AR的發生發展中起到一定作用，且CCL26可反映AR病情嚴重程度。此外，本研究中多因素Logistic回歸分析表明，CCL26是AR發生的獨立危險因素，提示CCL26可作為診斷AR發生的輔助指標。

CCR3是一種含7次跨膜結構的G蛋白耦聯非特異性受體，是CC型趨化因子的唯一受體。eotaxin-1、eotaxin-2、CCL26、單核細胞趨化因子、CCL5等均通過與CCR3結合后發揮作用。研究表明，eotaxins幾乎都是通過CCR3介導而發揮對嗜酸性粒細胞的趨化作用，且CCR3還能夠激活Th2細胞亞群，使其大量釋放炎性因子從而發生炎癥反應[16]。楊艷等[17]研究結果表明，慢性自發性蕁麻疹患者CCR3表達水平明顯高于健康者。DE CAMPOS等[18]研究顯示持續性變應性鼻炎患者鼻黏膜中CCR3表達水平上調。本研究結果顯示，與對照組比較，研究組AR患者外周血CCR3表達水平明顯升高，其水平隨AR病情的加重而升高。經Pearson相關分析法分析結果顯示AR患者外周血CCR3表達水平與SFAR評分呈正相關，與前述研究結果相近，提示CCR3表達水平與AR發生發展有關。CCR3可反映AR病情嚴重程度，推測可能是CCR3介導嗜酸性粒細胞聚集，而后激活的嗜酸性粒細胞通過釋放炎性介質參與炎癥性疾病的發生。多因素Logistic回歸分析表明，CCL26是AR發生的獨立危險因素，提示CCR3可輔助診斷AR的發生。

此外，經ROC曲線分析結果顯示，CCL26診斷AR患者的AUC為0.697，取最佳診斷界值2.914 ng/L時，相應的敏感度為51.2%，特異性為87.9%；CCR3診斷AR患者的AUC為0.752，取最佳診斷界值31.197時，相應的敏感度為62.8%，特異性為84.6%；兩者聯合檢測的AUC為0.833，敏感度為73.3%，特異性為86.8%。這說明CCL26、CCR3表達水平檢測對AR的診斷具有一定價值，但兩種方法聯合檢測優于單獨一種方法檢測。

綜上所述，CCL26、CCR3的表達水平與AR的發生有關，且其可判斷AR病情的嚴重程度，并為AR患者的診斷提供理論依據。