采供血機構血液HBV 篩查策略改進的探討

陳丹，王芳，張鵬飛，郭新宇，莊養(yǎng)林

(1.江西省職業(yè)病防治研究院檢驗科；2.江西省血液中心檢驗科，江西 南昌 330006)

為減少經血傳播病毒風險， 我國所有采供血機構在原有血清學試劑檢測病毒感染標志物的基礎上，全面增加病毒核酸檢測已有5年余，有效降低了乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及艾滋病病毒（HIV）經血傳播風險[1-4]。為進一步提升血液安全水平，國家衛(wèi)生健康委也印發(fā)了《血站技術操作規(guī)程（2019 版）》，其中4.2.4 檢測策略中指出：HIV、HBV 和HCV 感染標志物應至少采用核酸和血清學試劑各進行1 次檢測[5]。 目前本地區(qū)血液篩查模式為1 次核酸檢測加2 種血清學試劑檢測， 此檢測模式具體為2 種血清學試劑檢測結果為陰性情況下， 即實驗樣本吸光度值/臨界值（Sample optical density/Cut-off，S/CO） 小于臨界值（cut-off）時，再使用羅氏公司血液篩查核酸試劑進行病毒核酸檢測。 而在血液篩查過程中，工作人員發(fā)現(xiàn)當2 種血清學試劑檢測結果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間時， 根據試劑判定規(guī)則，此類標本血清學檢測結果會被判定為陰性， 將直接進行核酸檢測， 但羅氏核酸檢測模式6 混樣檢測取樣量較少（每人份167 μL），若檢測樣本中HBV DNA 濃度較低， 吸取到病毒顆粒進行擴增概率大為降低，容易造成病毒漏檢，從而造成乙肝病毒經血傳播的可能。 在發(fā)現(xiàn)了上述情況后，本實驗室及時優(yōu)化了相關檢測策略，現(xiàn)將有關工作介紹如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選自2018年1月1日至2020年12月31日南昌地區(qū)221 191 份無償獻血者標本。

1.2 主要儀器 瑞士哈密爾頓全自動酶免檢測儀FAME， 羅氏公司COBAS s 201 核酸檢測系統(tǒng)，瑞士Hamlton 全自動STAR 加樣儀， 長沙湘麓DL-6M 大容量低溫離心機。

1.3 主要試劑 核酸檢測試劑盒：COBAS TaqScreen MPX V2.0 test 核酸檢測試劑盒 （瑞士Roche 公司，批號：215559、232401 等），該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1,2 RNA、HCV RNA 和HBV DNA；HBsAg 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（廈門新創(chuàng)生物科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)有限公司， 批號：2019115136、2019095125、B20191141、B20190932 等）。

1.4 實驗方法 對無償獻血標本進行2 種血清學試劑檢測乙肝表面抗原（HBsAg），對HBsAg 檢測結果均為陰性的標本 （包括初次檢測反應性復查為陰性的標本）進行核酸檢測。

1.4.1 對2 種HBsAg 血清學試劑檢測S/CO 均小于50% cut-off 或1 種血清學試劑檢測S/CO 在50%～80% cut-off 的標本（以下稱常規(guī)核酸檢測標本） 按常規(guī)核酸檢測方式進行檢測， 即在全自動STAR 加樣儀上先匯集6 人份血清學試劑檢測結果為陰性的血清（每人份167 μL）到1 管（共匯集1 mL）中進行6 混樣檢測（以下稱PP6），若檢測結果為陰性則代表此6 人份樣本核酸檢測結果為陰性，若檢測結果為反應性，則需對此6 人份樣本進行拆分/單檢（以下稱PP1）（1 mL），以明確哪一人份血清為HBV DNA 反應性。統(tǒng)計PP6 反應性循環(huán)閾值（Cycle threshold values，Ct 值）和PP1 反應性Ct 值、HBV DNA 陽性率、拆分成功率。

1.4.2 對2 種HBsAg 血清學試劑檢測S/CO 均在50%～80% cut-off 的標本，直接進行PP1 檢測。 統(tǒng)計PP1 反應性Ct 值。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Excel 軟件對數據進行整理，計算各組Ct 值均值（x）、標準差（s）及拆分成功率，運用SPSS 10.0 軟件對數據進行分析，各組間Ct 值比較采用t 檢驗， 各組陽性率比較采用χ2檢驗，檢驗水準P=0.05。

2 結果

2.1 2018年至2020年PP6 反應性Ct 值中位數分別為37.8、37.5、37.3 ， 三年PP6 檢測Ct 值兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2018年至2020年PP6 Ct 值比較

2.2 2018年至2020年PP6 Ct 值在37.1 以上時，其PP1 檢測結果為陽性的情況分別為52.13%（49/94）、38.78%（19/49）、46.39%（45/97），2018年至2020年PP6 Ct 值在37.0 以下時，其PP1 檢測結果為陽性的情況分別為86.67%（26/30）、76.92%（20/26）、70.77%（46/65），其中2018年至2020年PP6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2，PP6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下其PP1 檢測陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表2 2018年至2020年PP6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下比較

表3 2018年至2020年PP6 Ct 值在37.1 以上與37.0 以下其PP1 檢測陽性率比較

2.3 兩種HBsAg 血清學檢測S/CO 均在50%～80%cut-off 的標本，直接進行PP1 檢測結果。三年兩種HBsAg 血清學檢測S/CO 均在50%～80%cut-off的標本共收集15 份，PP1 檢測均為反應性。三年此類標本PP1 檢測Ct 值均值分別為35.23、37.04、34.08，此類標本PP1 檢測Ct 值在36.0 以上標本占比此類PP1 檢測總數的53.33%， 顯示這類標本多數HBV DNA 濃度處于較低水平， 其中2019年標本9 和標本10 的PP1 檢測Ct 值達到40.7 和38.8，見表4，在另行的PP6 檢測中，標本4、6、10、11 檢測為無反應性，PP6 檢測Ct 值與PP1 檢測Ct值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 2018年至2020年S/CO 均在50%～80%cut-off 的標本檢測結果

3 討論

在國內采供血機構采用羅氏MPX V2.0 試劑進行血液篩查時， 都是對無償獻血標本進行2 種血清學試劑檢測HBsAg 結果均為陰性的標本行核酸檢測， 即先匯集6 人份血清學試劑檢測結果為陰性的血漿 （每人份167 μL） 到1 管 （共匯集1 mL）中進行PP6 檢測，若此管檢測結果為陰性則代表此6 人份樣本核酸檢測結果為陰性， 若檢測結果為反應性， 則需對此6 人份樣本分別進行PP1檢測，以拆出具體哪一人份血清為HBV DNA 反應性。 但PP6 反應性標本大多數經證實為OBI 獻血者或處于血清學檢測窗口期， 此類標本HBsAg 往往檢測為陰性，病毒載量往往較低[6]，若標本病毒載量低于核酸試劑混樣檢測下限， 其PP6 檢測很大概率檢測為無反應性。

從近三年常規(guī)核酸檢測標本PP6 檢測Ct 值、PP1 檢測Ct 值及PP6 反應性進一步拆分成功率統(tǒng)計結果來看，PP6 Ct 值在37.0 以下時，其拆分檢測PP1 結果為陽性的情況分別在86.67%（26/30）、76.92%（20/26）、70.77%（46/65），其中PP6 Ct 值在35.0 以下時， 三年PP1 檢測結果為陽性均為100%。PP6 Ct 值區(qū)間在35.1～36.0 時，2020年常規(guī)核酸檢測出現(xiàn)了兩次PP6 Ct 值為35.9 和36.0，而PP1 檢測結果為陰性的情況，故2020年PP6 Ct 值在35.1～36.0 之間的標本PP1 拆分成功率僅在78%。另外除2018年，其余兩年PP1 檢測陽性率均低于Wang 等[7]報道的PP6 Ct 值小于等于37.0 時拆分陽性率為80%， 這可能與檢測試劑或常年進行核酸篩查有關：Wang 等 進行PP6 檢測所用試劑為羅氏一代試劑MPX， 而本文所用試劑為二代試劑MPX V2.0， 兩種試劑特異性及靈敏度均存在差異， 另一個原因可能與長期進行血液核酸篩查，HBsAg-/HBV DNA+高病毒載量的標本已篩出，近幾年血液篩查標本以低病毒載量為主。 這從PP6 反應性標本多數處在Ct 值為36.1～39.0 之間，2018年至2020年此區(qū)間標本分別占比PP6 反應性總數的70.97%、73.33%和74.69%。曾勁峰等[8]通過確證實驗得出，25 例HBsAg-/HBV DNA+標本病毒載量介于不可檢出到至108.9 IU/mL， 歐山海等[9]對62 例HBsAg-/HBV DNA+標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中93.5%（58/62）的HBV DNA 是小于100 IU/mL。 因此對HBsAg-/HBV DNA+進行PP6 檢測，應慎之又慎，蔣瑞馨等[10]建議當PP6 Ct 值≤37 時可考慮重復PP1 檢測。

在日常檢測中， 工作人員發(fā)現(xiàn)個別PP6 反應性標本進行PP1 檢測時呈反應性， 同時查閱血清學檢測過程， 發(fā)現(xiàn)其2 種血清學試劑檢測結果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間， 然而根據試劑說明書規(guī)則， 此類標本血清學檢測結果會判定為陰性，按照篩查策略將此類標本進行PP6 檢測，恰巧PP6 檢測呈反應性。 鑒于目前進入PP6 檢測的標本以低HBV DNA 載量標本為主，因此工作人員對待此類標本進行HBV DNA 檢測開始謹慎起來， 因將此類標本進行PP6 檢測， 能否檢出HBV DNA 是個疑問。 為降低因HBV DNA 載量過低而超出核酸試劑檢測下限，造成病毒漏檢的風險，本實驗室調整了檢測策略， 即將2 種血清學試劑檢測結果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間的標本直接進行PP1 檢測。 根據統(tǒng)計結果， 此類標本PP1 檢測Ct 值在36.0 以上標本占比此類PP1 檢測總數的53.33%， 顯示這類標本多數HBV DNA濃度處于較低水平。 以常規(guī)PP1 檢測反應性Ct 值在36.0 以上，其對應的PP6 反應性Ct 值應在37.1以上， 而近三年PP6 Ct 值在37.1 以上時， 其PP1檢測結果為陽性的情況分別為52.13%（49/94）、38.78%（19/49）、46.39%（45/97）， 表現(xiàn)為較低的拆出陽性率。 其中2019年標本9 和標本10 的PP1檢測Ct 值達到40.7 和38.8，以及在另行的PP6 檢測中，標本4、6、10、11 檢測為無反應性，此種情況更加印證了我們將2 種血清學試劑檢測結果S/CO同時處在50%～80% cut-off 之間的標本，由PP6 檢測調整為直接進行PP1 檢測的必要。

目前羅氏血液篩查模式未有改變， 出于對進入核酸檢測的標本均為2 遍血清學檢測為陰性結果及檢測成本因素的考慮， 我國采供血機構采用羅氏MPX V2.0 進行血液篩查仍是PP6 模式，未直接采用PP1 的模式， 但2 種血清學試劑檢測結果S/CO 同時處在50%～80% cut-off 之間的標本對于此種模式仍是挑戰(zhàn)。 此類標本若采用羅氏既定的篩查模式，一種結果是混樣結果陰性，標本放行，即病毒漏檢。 另一種結果是混樣陽性進入PP1 檢測，即增加10 份核酸試劑用于PP1 檢測。 為兼顧檢測成本及降低傳染風險，讓此類標本單獨成為1個pool 即可在PP6 模式下對此份標本進行PP1 檢測，節(jié)約10 份用于PP1 檢測的核酸試劑（以本實驗室2018年至2020年數據統(tǒng)計可節(jié)約150 份核酸試劑，約4.5 萬元），按此種篩查模式在現(xiàn)行的檢測策略中既能更好地降低乙肝病毒經血傳播風險，又可以節(jié)約檢測成本。