LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p基因調控宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制研究

陳靜 葉暉 朱艷

宮頸癌是最常見的侵襲性婦科癌癥之一，是全球女性癌癥相關死亡的重要原因[1,2]。診斷和治療技術的進步極大改善了宮頸癌患者的治療。然而，由于宮頸癌的高度侵襲性和轉移能力，晚期癌癥患者的預后仍然很差[3]。此外，缺乏有效的篩選生物標志物和技術導致宮頸癌診斷不佳[4]。因此，了解宮頸癌的發生和轉移的潛在機制，并開發出新的治療策略來治療該病至關重要。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)與許多疾病有關，尤其是腫瘤[4]。LncRNA PITPNA反義RNA 1(PITPNA antisense RNA 1，PITPNA-AS1)是新發現的LncRNA，位于染色體17p13.3，在宮頸癌中高表達，并通過靶向miR-876-5p/c-MET軸調節宮頸癌的細胞周期和凋亡[5]。但LncRNA PITPNA-AS1對宮頸癌細胞遷移和侵襲的作用尚不清楚。競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)理論的提出加快了人們對LncRNA的探索，LncRNA通過ceRNA調節微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)的表達[6]。miR-491-3p是已報道的腫瘤抑制因子，在視網膜母細胞瘤[7]、骨肉瘤[8]中低表達，并抑制視網膜母細胞瘤和骨肉瘤細胞生長和轉移。本研究的生物信息學預測到LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p之間存在靶向結合位點，這表明LncRNA PITPNA-AS1可能通過miR-491-3p與宮頸癌進展相關。因此，本研究LncRNA PITPNA-AS1在宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲中的功能和機制進行考察，為宮頸癌新療法的開發提供新的啟示。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞系(HeLa、SiHa、Caski)、宮頸上皮永生化細胞H8(上海雅吉生物公司)，siRNA陰性對照(si-NC)、siRNA LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1)、miR-491-3p mimics、miR-491-3p inhibitors(anti-miR-491-3p)、mimics/inhibitors陰性對照(miR-NC/anti-miR-NC)、pcDNA、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(廣州RiboBio)，Revert AidTM Frist Strand cDNA試劑盒(加拿大Fermentas)，RIPA緩沖液、β-肌動蛋白(β-actin)一抗(美國Sigma-Aldrich)，BCA蛋白質測定試劑盒(美國Promega Corporation)，細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8；日本Dojindo公司)，Matrigel(美國EMD Millipore)，pmirGLO雙熒光素酶報告載體、Dual-Glo熒光素酶測定試劑盒(美國Promega)。

1.2 細胞培養與分組 宮頸癌細胞HeLa、SiHa、Caski、宮頸上皮永生化細胞H8均維持在補充有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培養基中，并保持在37℃，5% CO2的濕潤氣氛中。將未處理的宮頸癌細胞HeLa設為對照(NC組)。根據Lipofectamine 2000試劑的說明，在宮頸癌細胞HeLa中轉染si-NC(si-NC組)、si-LncRNA PITPNA-AS1(si-LncRNA PITPNA-AS1組)、miR-NC(miR-NC組)、miR-491-3p mimics(miR-491-3p組)、pcDNA(pcDNA組)、pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1(pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1組)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-NC(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組)、si-LncRNA PITPNA-AS1和anti-miR-491-3p(si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p組)。轉染48 h后收獲細胞。

1.3 qRT-PCR檢測LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p表達 TRIzol試劑(每1×106細胞1 ml)用于提取細胞總RNA。溶解后，使用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit結合特異性引物和逆轉錄酶將RNA(2.5 μl)逆轉錄成cDNA。隨后使用Revert AidTM Frist Strand cDNA試劑盒擴增cDNA。記錄每個樣品的閾值(Ct值)，并使用2-ΔΔCt方法進行分析。將數據標準化為GAPDH(對于LncRNA)或U6(對于miRNA)。引物序列如下所示：LncRNA PITPNA-AS1：5’-GCAGGGTGGATAAAGAGGA-3’(正向)和5’-CCT

ACTGACAGGATGTCCT-3’(反向)；miR-491-3p：5’-’-ATGCAAGATTCCCTTCTACAAA-3’(正向)和5’-CAT

GATCAGCTGGGCCAAGA-3’(反向)；GAPDH：5’-GAA

GGTGAAGGTCGGAGT-3’(正向)和5’-GAAGATGGTG

ATGGGATTTC-3’(反向)；U6：5’-CTCGCTTCGGCAGC

ACA-3’(正向)，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(反向)。

1.4 Western Blot檢測細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基質金屬蛋白酶(Matrix metalloprotease，MMP)-2、MMP-9蛋白表達 用RIPA緩沖液裂解每組宮頸癌細胞HeLa。使用BCA蛋白質測定試劑盒進行蛋白質定量。通過10% SDS-PAGE分離總共50 μg/泳道蛋白質，然后將其轉移到聚偏二氟乙烯膜上。然后在室溫下用脫脂乳在Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween，TBST)中將膜封閉1 h。將膜與抗CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗和抗β-actin一抗(均為1∶1 000)在4℃下過夜。然后，將膜用TBST緩沖液洗滌，用辣根過氧化物酶偶聯的抗兔抗體(1∶10 000)在室溫保持2 h。使用Pierce ECL Western印跡底物可視化蛋白條帶。蛋白質水平通過β-actin進行標準化，并使用ImageJ軟件評估條帶密度。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖 將宮頸癌細胞HeLa以2×103個細胞/孔的量接種在96孔板上，每組3孔。使用CCK-8在48 h時測量細胞增殖。向每個孔中總共加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)。在37℃溫育4 h后，在450 nm處測定吸光度A值。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲 將宮頸癌細胞HeLa在無血清RPMI-1640培養基中，以5×104細胞/100 μl的密度接種到未涂(遷移測定)或預先涂有(侵襲測定)Matrigel膠(37℃放置2 h)的24孔Transwell板上層隔室中。下腔室裝有500 μl RPMI-1640培養基，其中添加了10% FBS。在37℃下孵育24 h后，將穿過膜的細胞在室溫下用75%甲醇固定15 min，然后在用0.1%結晶紫染色15 min。在Nikon光學顯微鏡下觀察侵襲細胞。

1.7 雙熒光素酶活性檢測 用LncBase Predicted v.2軟件預測LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p的結合區域。將含有miR-491-3p結合位點的LncRNA PITPNA-AS1-野生型(WT)片段插入pmirGLO雙熒光素酶報告載體中以產生LncRNA PITPNA-AS1(WT)。將突變型(MUT)LncRNA PITPNA-AS1片段插入pmirGLO雙熒光素酶報告載體，合成LncRNA PITPNA-AS1(MUT)。為了進行報告基因檢測，將宮頸癌細胞HeLa接種到24孔板中，24 h后將上述報告質粒與miR-491-3p mimics或miR-NC一起使用Lipofectamin 2000共轉染到宮頸癌細胞HeLa中。溫育48 h后，收集轉染的細胞，通過Dual-Glo熒光素酶測定試劑盒來測量相對熒光素酶活性。

2 結果

2.1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宮頸癌細胞系中的表達情況 宮頸癌細胞系HeLa、SiHa、Caski中LncRNA PITPNA-AS1表達水平均比宮頸上皮永生化細胞H8高，miR-491-3p表達水平均比宮頸上皮永生化細胞H8低，差異有統計學意義(P<0.05)。選擇差異最顯著的宮頸癌細胞HeLa進行后續研究。見表1。

表1 LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p在宮頸癌細胞系中的表達情況

2.2 LncRNA PITPNA-AS1低表達抑制宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲 在宮頸癌細胞HeLa中低表達LncRNA PITPNA-AS1，與NC組比較，si-NC組LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平、細胞增殖、遷移和侵襲均差異無統計學意義(P>0.05)。而si-LncRNA PITPNA-AS1組LncRNA PITPNA-AS1、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平比NC組低，細胞增殖、遷移和侵襲數量也低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 LncRNA PITPNA-AS1低表達抑制宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移和侵襲

圖1 LncRNA PITPNA-AS1低表達抑制宮頸癌細胞HeLa遷移，侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平(結晶紫染色×100);A Transwell檢測細胞遷移和侵襲;B Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達

2.3 miR-491-3p抑制宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移、侵襲 在宮頸癌細胞HeLa中過表達miR-491-3p，miR-491-3p組miR-491-3p表達水平比miR-NC組高，但CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平、細胞增殖、遷移和侵襲數量均比miR-NC組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-491-3p抑制宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移、侵襲

圖2 miR-491-3p抑制宮頸癌細胞HeLa遷移、侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白質表達水平;A Transwell檢測下撥遷移和侵襲(結晶紫染色×100)；B Western Blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達

2.4 LncRNA PITPNA-AS1靶向miR-491-3p，調控miR-491-3p的表達 miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1靶向結合在LncBase Predicted v.2軟件中預測。miR-491-3p組LncRNA PITPNA-AS1(WT)報告質粒共轉染的HeLa細胞相對熒光素酶活性比miR-NC組低，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-491-3p組與miR-NC組LncRNA PITPNA-AS1(MUT)報告質粒共轉染的HeLa細胞相對熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。miR-491-3p表達水平在pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1組中低于pcDNA組，在si-LncRNA PITPNA-AS1組中卻高于si-NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 LncBase Predicted v.2對miR-491-3p和 LncRNA PITPNA-AS1結合進行預測示意圖

表4 miR-NC或miR-491-3p與報告質粒共轉染HeLa細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-491-3p的表達

2.5 anti-miR-491-3p逆轉LncRNA PITPNA-AS1低表達對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用在宮頸癌細胞HeLa中同時低表達miR-491-3p和LncRNA PITPNA-AS1，si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-491-3p組miR-491-3p表達水平比si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平、細胞增殖、遷移和侵襲數量高于si-LncRNA PITPNA-AS1+anti-miR-NC組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 anti-miR-491-3p逆轉LncRNA PITPNA-AS1低表達對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用

圖4 anti-miR-491-3p逆轉LncRNA PITPNA-AS1低表達對宮頸癌細胞HeLa遷移、侵襲以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平的抑制作用;

3 討論

越來越多的研究表明，LncRNA的異常表達與各種人類癌癥的進展密切相關。例如，lncRNA FTH1P3通過靶向miR-145在宮頸癌中起促癌因子的作用[9]。LncRNA PTENP1通過抑制miR-106b抑制宮頸癌進展[10]。資料顯示，Sun等[11]在肝癌組織中觀察到LncRNA PITPNA-AS1的升高，然后證明過表達LncRNA PITPNA-AS1通過miR-876-5p/WNT5A途徑可以促進肝癌細胞的增殖和運動。LncRNA PITPNA-AS1在非小細胞肺癌組織和細胞系中高表達，LncRNA PIPTNA-AS1沉默通過靶向miR-32-5p抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移[12]。LncRNA PITPNA-AS1可通過miR-129-5p/HMGB1軸促進結直腸癌細胞的增殖和遷移[13]。盡管以前的研究表明，LncRNA PITPNA-AS1過表達對宮頸癌細胞的增殖具有促進作用[5]，但仍缺乏關于LncRNA PITPNA-AS1對宮頸癌轉移作用的探索，因此需要進一步分析。這項研究與此前的數據一致，LncRNA PITPNA-AS1在宮頸癌細胞系中的表達明顯上調。本研究首次表明，低表達LncRNA PITPNA-AS1可顯著抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。此外，低表達LncRNA PITPNA-AS1的宮頸癌細胞增殖和相關蛋白CyclinD1、MMP2、MMP9表達被抑制。總體而言，這些研究表明LncRNA PITPNA-AS1可能起癌基因的作用，并有利于宮頸癌的發生和發展。

LncRNA作為海綿發揮調節miRNA的作用[14]。本研究生物學預測后，發現LncRNA PITPNA-AS1與miR-491-3p之間存在緊密聯系。miR-491-3p在宮頸癌細胞系中低表達，并與LncRNA PITPNA-AS1表達相反，暗示miR-491-3p可能由LncRNA PITPNA-AS1介導。這個假設已通過雙熒光素酶活性檢測得到了驗證。在用si-LncRNA PITPNA-AS1處理的宮頸癌細胞HeLa中，miR-491-3p被促進，而pcDNA-LncRNA PITPNA-AS1處理后，其表達被抑制，這表明LncRNA PITPNA-AS1可以充當miR-491-3p海綿，負向調控miR-491-3p。此前研究表明，miR-491-3p與多種癌癥有關，例如肝癌、結腸癌[15,16]。miR-491-3p在膠質母細胞瘤中下調，miR-491-3p抑制膠質瘤細胞侵襲、增殖，并損害了膠質瘤干細胞的增殖。miR-491-3p在15對視網膜母細胞瘤組織和細胞系中顯著下調。miR-491-3p的過度表達增強了視網膜母細胞瘤細胞凋亡，并顯著抑制了視網膜母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。相反，miR-491-3p抑制劑導致相反的結果[7]。miR-491-3p在骨肉瘤組織和細胞系中的表達經常降低，其表達的恢復抑制了骨肉瘤細胞的生長和侵襲[8]。可見，miR-491-3p是腫瘤的抑制因子。本研究揭示了過表達miR-491-3p可以減弱宮頸癌細胞中的細胞增殖、遷移和侵襲，與前人研究相吻合[17]。此外，anti-miR-491-3p逆轉了si-LncRNA PITPNA-AS1對宮頸癌細胞HeLa增殖、遷移、侵襲的抑制作用，表明LncRNA PITPNA-AS1通過靶向miR-491-3p發揮在宮頸癌中發揮作用。

總之，本研究表明，LncRNA PITPNA-AS1和miR-491-3p參與宮頸癌細胞的細胞增殖、遷移和侵襲過程。LncRNA PITPNA-AS1加速宮頸癌細胞的生長和轉移，機制與靶向miR-491-3p有關。這些結果可能為宮頸癌提供潛在的治療目標和策略，以阻礙宮頸癌的進展。