蒲參膠囊對心肌梗死動物模型心室重構(gòu)和心室舒縮功能的影響

朵杰 白潔 韓瓊

心室重構(gòu)是心肌梗死(myocardial infarction，MI)引起的心功能減退的常見原因，心肌組織的損傷和異常增生會直接影響心臟的收縮能力和射血功能[1]。而心臟纖維化則是導(dǎo)致心室重構(gòu)最主要因素，研究顯示MI后會引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達的身高，進而會激活Smad蛋白，從而調(diào)控細胞增殖和分化，并促進心臟纖維化引起心室重構(gòu)[2,3]。但是目前尚無有效的提高MI后心功能和緩解心室重構(gòu)的特效藥物。蒲參膠囊是一種中藥復(fù)方制劑，具有改善微循環(huán)、保護心肌缺血/再灌注損傷等有益效果[4]。總上，本研究主要分析蒲參膠囊對MI后心室重構(gòu)和射血功能的影響，并分析其對TGF-β1/Smad通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF級，雄性，8～10周，270～290 g)45只。HP SONOS 5500 型的超聲心動圖儀(飛利浦公司，美國)。蒲參膠囊(Z20040074，蘇中藥業(yè)，中國)。HE染色試劑盒購自武漢華美公司(中國)。顯微鏡(Olympus 公司，日本)。ELISA染色試劑盒(碧云天公司，中國)。酶標儀(Model 680，Bio-Rad，美國)。RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國)。BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國)。抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋，#ab6721)(Abcam公司，美國)。聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore，美國)。ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)。

1.2 分組、建模與干預(yù) 45只大鼠隨機分為對照組、MI組和MI+蒲參膠囊組(n=15)。根據(jù)參考文獻建立MI大鼠模型[5]，將MI組和MI+蒲參膠囊組的大鼠連接心電圖，麻醉(4%水合氯醛)后連接心電圖，后迅速打開胸小心撕開心包腔暴露心臟，利用5-0號縫合線結(jié)扎冠脈降支，但不需要結(jié)扎很近，心電圖ST段升高至>0.5 mV即可。然后，將心臟迅速放回胸腔內(nèi)，簡單縫合胸腔，腹腔注射8×105U的青霉素預(yù)防感染。對照組大鼠僅暴露心臟相同時間但不結(jié)扎。MI+蒲參膠囊組大鼠在建模后通過蒲參膠囊灌胃處理，劑量為40 mg/kg[6]，1次/d，連續(xù)4周。

1.3 方法

1.3.1 心功能檢測:通過HP SONOS 5500 超聲心動圖儀的雙通道左心室射血分數(shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)，從而評估心室射血功能和收縮功能。

1.3.2 心室重構(gòu)情況:吸入過量二氧化碳安樂死大鼠，測量體重(g)；取出心臟組織并稱重(mg)；然后分理處心室組織并稱重(mg)。通過檢測心臟和心室組織與體質(zhì)量的比值(mg/g)作為心臟指數(shù)和心室指數(shù)，從而分析心室重構(gòu)情況。

1.3.3 HE染色:HE染色檢測大鼠左心室心肌組織的病理變化。心肌組織組織用10%甲醛溶液固定48 h，流水沖洗。不同濃度的乙醇脫水，然后將組織浸入蠟中，并切成 4～7 μm 的厚度。將載玻片置于 65℃恒溫烘箱中 30 min。脫蠟切片用不同濃度乙醇浸泡5 min，自來水沖洗10 min。然后將切片分別用伊紅溶液染色1～2 min。細胞核用蘇木精染色5 min。染色切片用純酒精脫水并在光學(xué)顯微鏡下檢查。

1.3.4 RT-qPCR:使用RNeasy Mini試劑盒取將左心室心肌組織中的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進行qPCR實驗，條件如下：95℃/2 min， 94℃/20 s，58℃ 20 s，72℃/20 s，40個循環(huán)，最后在72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計算TGF-β1和Smad mRNA相對表達水平。

1.3.5 Western blot檢測蛋白:將左心室心肌組織織用勻漿機均勻研磨萃取總蛋白，通過BCA試劑盒測量濃度。每組取40 μg的總蛋白使用SDS-PAGE分離(10%，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室溫孵育1 h。將1∶500稀釋的TGF-β1和Smad一抗添加膜中(4℃，12 h)。洗滌后在加入1∶2 000稀釋的二抗孵育室溫下1 h。利用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 蒲參膠囊對MI大鼠心功能的影響 3組大鼠的左心室舒縮功能比較差異顯著(P<0.05)。MI組LVE和LVFS顯著低于對照組(P<0.05)，MI+蒲參膠囊組心臟指數(shù)LVEF和LVFS顯著高于MI組(P<0.05)。見表1。

表1 蒲參膠囊對MI大鼠心功能的影響

2.2 蒲參膠囊對MI大鼠心室重構(gòu)的影響 3組大鼠的心臟指數(shù)和心室指數(shù)比較差異顯著(P<0.05)。MI組心臟指數(shù)[(3.94±0.42)mg/g]和心室指數(shù)[(2.38±0.25)mg/g]顯著高于對照組(P<0.05)，MI+蒲參膠囊組心臟指數(shù)[(2.86±0.31)mg/g]和心室指數(shù)[(1.56±0.16)mg/g]顯著低于MI組(P<0.05)。見表2。

表2 蒲參膠囊對MI大鼠心臟指數(shù)和心室指數(shù)的影響

2.3 蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織損傷的影響 對照組細胞核染色清晰，細胞質(zhì)染色均勻，細胞排列有序。MI組細胞核染色變深或變淺，心肌細胞染色變淺，形狀發(fā)生改變，排列紊亂，并且細胞外基質(zhì)大量增生。MI+蒲參膠囊組組細胞排列異常和損傷情況均較輕。見圖1。

圖1 蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織損傷的影響(HE染色×400)

2.4 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表達水平的影響 3組大鼠左心室心肌組織中TGF-β1和Smad mRNA表達水平比較差異顯著(P<0.05)。MI組的TGF-β1和Smad mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，MI+蒲參膠囊組的TGF-β1和Smad mRNA水平顯著低于MI組(P<0.05)。見表3。

表3 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表達水平的影響

2.5 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響 3組大鼠左心室心肌組織中TGF-β1和Smad蛋白表達水平比較差異顯著(P<0.05)。MI組的TGF-β1和Smad蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，MI+蒲參膠囊組的TGF-β1和Smad蛋白水平顯著低于MI組(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 Western blot檢測蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響

表4 蒲參膠囊對MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表達水平的影響

3 討論

每年約有1 730萬的患者死于心血管疾病，是公共衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的重大挑戰(zhàn)[7]。心肌梗死是最常見的心血管疾病之一，會導(dǎo)致心室功能障礙、耗氧量增加和心肌細胞的凋亡，并且出現(xiàn)膠原纖維增生，最終引起心室重構(gòu)和心肌纖維化[8]。

蒲參膠囊是一種由何首烏、蒲黃、丹參、川芎、赤芍、山楂、澤瀉組成的膠囊劑，其具有活血祛淤，滋陰化濁之功效[9]。現(xiàn)階段，臨床上蒲參膠囊重要用于治療高血脂引起的心腦血管病變，或者用于減輕腦梗死相關(guān)疾病[10,11]。如一項臨床研究顯示蒲參膠囊可通過保護血管緩解輕度認知障礙[11]。MI過程與腦梗死相似，為研究蒲參膠囊對MI的影響，本研究通過栓線法構(gòu)建MI大鼠模型，并通過蒲參膠囊灌胃干預(yù)4周。結(jié)果顯示MI模型大鼠的LVEF和LVFS降低，說明左心室射血功能和舒縮功能異常，并且心臟指數(shù)和心肌指數(shù)升高，提示出現(xiàn)心肌增生重構(gòu)。蒲參膠囊能夠顯著恢復(fù)MI大鼠的心功能，并減少左心室心肌組織損傷和心室重構(gòu)。MI過程會導(dǎo)致大量活性氧自由基的生成，從而誘發(fā)細胞內(nèi)的炎性反應(yīng)，有研究顯示蒲參膠囊可緩解心肌缺血再灌注損傷抑制炎性反應(yīng)。結(jié)合文獻報道和本次研究結(jié)果，說明蒲參膠囊能夠緩解MI大鼠的心肌損傷，并抑制心室重構(gòu)，保護心室舒縮功能從而改善心臟的射血功能。

本研究檢測了蒲參膠囊對MI大鼠左心室心肌組織中TGF-β1/Smad通路轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的影響。如前所述，MI后誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)等均會引起心肌組織的纖維化，從而導(dǎo)致心室重構(gòu)并導(dǎo)致心肌組織失去彈性影響射血功能[12]。TGF-β1是纖維化最關(guān)鍵因子之一，其高表達會激活Smad的轉(zhuǎn)錄功能，從而促進膠原蛋白或者細胞外基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致心臟纖維化[13]。并且抑制TGF-β1/Smad可顯著的抑制纖維化保護心功能[14]。本次研究結(jié)果顯示MI模型大鼠左心室心肌組織中TGF-β1、Smad mRNA和蛋白水平顯著升高，而蒲參膠囊抑制則可顯著的抑制TGF-β1和Smad的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。劉永萍等[15]研究顯示蒲參膠囊可顯著抑制TGF-β1的表達，從而保護動脈粥樣硬化患者的血管功能。結(jié)合文獻報道和本次研究結(jié)果，提示蒲參膠囊可能通過抑制TGF-β1/Smad通路緩解心肌損傷和心室重構(gòu)，從而保護心室的射血功能。

綜上所述，蒲參膠囊可能緩解MI大鼠心室重構(gòu)改善心室的射血功能，并抑制TGF-β1/Smad通路。本研究結(jié)果提示蒲參膠囊可有效的保護MI后的心臟功能，可能成為治療MI的新方法。