熒光標記的錳羰基化合物一氧化碳釋放研究

王雪梅 張俊蝶 李卓芹 馬明慧 汪慧云 姜秀娟

嘉興學院生物與化學工程學院（浙江嘉興 314001）

眾所周知，一氧化碳（CO）是一種有毒氣體。但研究表明，CO與NO類似，是生物體內一種重要的氣體信使分子，能夠在生物體內發揮重要的調節作用，如抗菌、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、舒張血管等[1-2]。但是，CO由于固有的毒性，過量使用會導致生物體中毒甚至死亡。因此，如何安全有效地使用這種生物分子就成為科學家們探索的重要課題。一氧化碳釋放分子（CORMs）是一種CO供體[3-5]，其攜帶的CO基團在一定條件下可以解離并以CO的形式釋放出來，能夠發揮和內源性CO相同的作用。

過渡金屬羰基化合物是目前研究最廣泛的CORMs[6-9]，其中的羰基基團在一定條件下會解離，如在光照、酶誘導或取代作用下以CO的形式釋放出來。在這些誘導方式中，光誘導一氧化碳釋放分子（photoCORMs）的研究引起了科學家們的廣泛興趣[7,10-11]。光誘導時，只需要選擇合適的光源即可方便地調控CO釋放速率，而且不會引入其他物質。但是，目前文獻報道的photoCORMs所采用的光源多為波長較短、能量較高的紫外光或可見光[7,12-13]。這些波長的光對皮膚的穿透力很弱，需要開發對皮膚穿透能力強的波長較長的可見光或近紅外光誘導的photoCORMs。

錳在自然界中分布非常廣泛，而且是一種維持生物體基本功能的微量元素[14-15]，因此基于錳的CORMs在生物兼容性方面優于其他金屬元素。此外，羰基錳化合物一般在光照作用下容易分解，可以作為光誘導的一氧化碳釋放分子。為了解決photo-CORMs所采用光源能量較高、波長較短的問題，本研究希望增強錳羰基化合物的共軛性來改善其光化學性能。此外，為了更好地實現生物體內對CORMs釋放CO的監測，引入熒光配體來提高其發光性能。因此，利用5-氨基熒光素、2-氨基吡啶和五羰基溴化錳反應合成了相應的含希夫堿配體的錳羰基化合物。該化合物在黑暗中具有很好的穩定性，但是對光非常敏感，因此進一步研究了其在不同LED可見光（藍光、綠光或紅光）作用下的分解情況。結果表明，該化合物在上述可見光作用下能夠分解釋放CO，可以作為光誘導的CORMs，該CO釋放過程符合一級動力學模型。該化合物分解釋放CO的速率可以通過選取不同光源來調節，具有很好的可控性，是一種具有很好應用前景的photoCORMs。另外，該化合物在500～700 nm波段可以發射較強熒光，預期可以作為熒光標記的CORMs，為研究細胞及生物體內CORMs的分布及CO釋放提供可能。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

五羰基溴化錳、5-氨基熒光素、2-吡啶甲醛、甲醇、二甲基亞砜（DMSO），分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

RCT基本型磁力加熱攪拌儀，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；400 MR核磁共振儀、Cary 640傅里葉變換紅外光譜儀、Cary Eclipse熒光分光光度計，安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 錳羰基化合物[Mn(CO)3(L)Br]（1）的合成

將5-氨基熒光素（104 mg，0.3 mmol）置于50 mL圓底燒瓶中并加入5 mL甲醇溶解，在攪拌下加入2-吡啶甲醛（28μL，0.3 mmol）和五羰基溴化錳（74 mg，0.3 mmol），保持回流2 h后有大量紅色沉淀生成。

1.2.2 目標化合物的表征

反應液冷卻后抽濾得到紅色固體。目標化合物產率為80%，質量分數為99.2%。

1.3 CO釋放的監測

取化合物1（6.5 mg，0.01 mmol），加入2.0 mL DMSO溶解，配制成溶液；將不同光源（LED藍、綠和紅光，藍光波長為470～475 nm、綠光波長為492～577 nm、紅光波長為622～770 nm）置于溶液上方13 cm處進行照射，并從溶液中不定時取樣測試其紅外光譜變化情況。

1.4 熒光性能測試

配制化合物1的DMSO貯存溶液（0.01 mol/L），將其稀釋至3×10-5mol/L后進行熒光光譜性能測試（激發波長為460 nm，狹縫寬度為10 nm）。

2 結果與討論

2.1 化合物1的合成

化合物1通過五羰基溴化錳、5-氨基熒光素和2-吡啶甲醛在甲醇中回流反應2 h得到（見圖1）。該化合物在極性較大的有機溶劑（如二甲亞砜）中有很好的溶解性，在其他溶劑中較難溶解。此外，該化合物在黑暗中很穩定，但是對光非常敏感，經光照后即可分解。

圖1 化合物1的合成路線

2.2 化合物1在光誘導作用下分解釋放CO研究

由于化合物1對光不穩定，預期可以作為光誘導的一氧化碳釋放劑。錳羰基化合物含有羰基基團，因此可以通過液體紅外光譜觀察其羰基峰的變化來監測化合物的分解。化合物1在2 026，1 936和1 916 cm-1處分別呈現3個典型的紅外羰基特征峰，在避光條件下，該特征峰基本不會發生變化；但是光照時，這些紅外峰會發生顯著變化。如圖2（a）所示，化合物1的紅外特征峰在LED藍光照射下會迅速減弱，并逐漸在1 873 cm-1處出現一個新的紅外峰，而且在1 936和1 916 cm-1處雙峰的形狀也發生了變化，說明在藍光作用下化合物1會很快分解，并生成新的反應中間體。此外，分別研究了該化合物在綠光和紅光作用下的分解情況，結果見圖2（b）和圖2（c）。類似的，化合物1的3個羰基特征峰在綠光和紅光照射下逐漸減弱，只是減弱速率較藍光小很多，紅光作用下降低最慢。與藍光下紅外光譜變化不同的是，綠光和紅光作用下僅僅是化合物1羰基特征峰的減弱，并沒有產生新的紅外峰，說明在這兩種光作用下化合物1發生分解，但僅是化合物的簡單分解，并沒有產生新的中間體。上述結果表明藍光促進化合物1分解的作用最顯著，綠光次之，而紅光的分解效果最弱。

圖2 化合物1在LED藍光（a）、綠光（b）和紅光（c）照射下的紅外光譜

2.3 化合物1光誘導分解動力學研究

通過分析上述反應的動力學過程進一步研究了化合物1的分解速率與光源之間的關系，結果見圖3。如圖3所示，對不同可見光作用下化合物1的濃度自然對數（ln c）和時間（t）作圖可得直線，說明化合物1在上述可見光作用下的分解，即CO釋放過程，符合準一級動力學模型。因此，根據一級動力學反應可以計算出化合物1分解釋放CO的動力學數據（其中kobs為反應速率常數，t1/2為反應半衰期）。表1為光誘導化合物1分解的動力學結果。從表1可以看出，在不同的光源下，化合物1的分解速率不同。藍光作用下，化合物1的分解最快，半衰期僅為2.9 min；綠光下分解較慢，其半衰期是藍光下的65倍；而紅光下分解最慢，其半衰期是藍光下的82倍。因此，化合物1光誘導分解釋放CO的速率取決于所用光源，其原因在于不同光源的波長不同，能量差別也非常大。在上述3種光源中，紅光的波長最長，所提供的能量最小，其斷裂金屬與羰基間化學鍵的能力最弱；而藍光波長最短，能量也最高，使金屬與羰基間化學鍵斷裂的能力最強；綠光波長和能量均介于紅光與藍光之間，斷裂金屬羰基化學鍵的能力也居中。因此，本研究可以方便地通過選取不同光源來調控化合物1分解釋放CO的速率，該化合物可以作為具有應用前景的photoCORMs。眾所周知，光動力學治療具有創傷小、毒性低、選擇性和適用性好等優點。目前，臨床上光動力學治療普通或惡性腫瘤一般采用630 nm的激光進行體外或通過內窺鏡進行體內照射，可以達到很好的治療效果。本研究中，化合物1在波長較長的紅光（622～770 nm）作用下可以較慢地分解釋放CO，預期可以作為具有很好應用前景的光動力學治療的photoCORMs藥物。

圖3 化合物1在不同LED光照作用下ln c隨時間的變化

表1 化合物1在不同LED光照下反應的動力學結果

圖3 化合物1在DMSO中的熒光光譜（λex=460 nm）

2.4 化合物1的熒光光譜研究

作為一種藥物分子，CORMs在體內的分布及其CO釋放對于充分理解并有效利用CO的生理和病理功能具有十分重要的意義。進一步研究了化合物1的熒光發射光譜情況，結果見圖4。在460 nm波長光激發下，化合物1在500～700 nm區域可以發射較強熒光，其最大發射波長為528 nm。因此，化合物1可以作為一種潛在的CORMs熒光標記物，為研究CORMs在細胞及體內的分布變遷及控制CO釋放提供可能。

3 結論

合成了基于熒光素衍生物配體的錳羰基化合物，該化合物在LED藍光、綠光或紅光照射下可分解并釋放CO，可作為光誘導的一氧化碳釋放分子。此外，該CO釋放過程符合一級反應動力學模型，即化合物的分解半衰期僅取決于其反應速率常數，與其初始濃度無關。化合物1分解釋放CO的速率可以調控，只需選擇不同光源即可實現，具有方便易控的優點。此外，該化合物還可以發射較強熒光，為實現生物體內成像以及進一步研究CORMs在體內的分布及釋放提供可能，預期在醫藥領域具有潛在的應用前景。