芪連結腸寧對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織中NF-κB相關通路蛋白及血清炎癥因子的影響

胡錦洋 王璇 蔣士生

〔摘要〕 目的 研究芪連結腸寧對潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC）模型大鼠結腸組織中NF-κB相關通路蛋白及血清炎癥因子的影響。方法 選取36只大鼠采用3%葡聚糖硫酸鈉喂養建立UC模型，并隨機分為模型組、水楊酸柳氮磺胺吡啶（salicylazosulfapyridine， SASP）組、芪連結腸寧組，每組12只。另取12只大鼠為空白組。造模后，SASP組予SASP藥液0.27 g/kg，芪連結腸寧組予芪連結腸寧藥液3.5 g/kg，空白組和模型組予生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續28 d。觀察治療前后大鼠體質量、大便性狀、便血情況，并計算疾病活動指數（disease activity index， DAI）。治療后，HE染色法觀察各組大鼠結腸組織病理變化情況;ELISA法檢測各組大鼠血清中白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-2（interleukin-2， IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量;Western blot檢測各組大鼠結腸組織中Toll樣受體-4（Toll like receptor-4， TLR-4）、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）蛋白表達情況。結果 治療第14、21、28天，SASP組、芪連結腸寧組體質量及DAI評分均明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01）;芪寧結腸寧組體質量均明顯高于SASP組（P<0.05，P<0.01）。模型組結腸組織明顯有黏膜損傷;SASP組、芪連結腸寧組結腸組織病理損傷均不同程度恢復，炎性浸潤減輕。與空白組比較，模型組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達明顯升高（P<0.01），IL-2含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，SASP組、芪連結腸寧組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達明顯降低（P<0.01），IL-2含量明顯升高（P<0.01）。與SASP組比較，芪連結腸寧組TLR-4、MyD88蛋白表達明顯升高（P<0.01），NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.01）。結論 芪連結腸寧可能是通過抑制TLR-4蛋白活性，減少其下游的NF-κB的活化，進而調控促炎和抗炎因子的平衡，減少腸道炎癥反應，從而發揮對UC的治療作用。

〔關鍵詞〕 潰瘍性結腸炎;芪連結腸寧;炎癥因子;Toll樣受體-4;髓樣分化因子88;核轉錄因子-κB

〔中圖分類號〕R259 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.002

Effect of Qilian Jiechangning Decoction on NF-κB related pathway proteins in colon tissue and serum inflammatory factors in UC model rats

HU Jinyang1， WANG Xuan2*， JIANG Shisheng1*

（1. Affiliated Hospital of Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410000， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the Qilian Jiechangning Decoction on NF-κB related pathway proteins in colon tissue and serum inflammatory factors in ulcerative colitis （UC） model rats. Methods A total of 36 rats were selected and fed with 3% sodium dextran sulfate to establish UC model， and randomly divided into model group， salicylazosulfapyridine （SASP） group， Qilian Jiechangning group， with 12 rats in each group. Another 12 rats were selected as blank group. After modeling， SASP group was given SASP solution 0.27 g/kg， Qilian Jiechangning group was given Qilian Jiechangning group solution 3.5 g/kg， blank group and model group were given normal saline once a day， for consecutive 28 d. The body weight， stool characteristics and hematochezia of rats were observed before and after treatment， and the disease activity index （DAI） was calculated. After treatment， HE staining was used to observe the pathological changes of colon tissues in each group. The serum levels of interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-2 （IL-2）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-8 （IL-8） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in rats were detected by ELISA. Western blot was used to detect the expression of toll-like receptor-4 （TLR-4）， nuclear factor-κB （NF-κB） and myeloid differentiation factor 88 （MyD88） in colon tissues of rats in each group. Results On the 14th， 21st and 28th days of treatment， the body weight and DAI score of the SASP group and the Qilian Jiechangning group were significantly decreased than those of the model group （P<0.05， P<0.01）; the body weight of Qilian Jiechangning group was significantly increased than the SASP group （P<0.05， P<0.01）. The colon tissue of the model group had obvious mucosal damage; the pathological damage of the colon tissue in the SASP group and Qilian Jiechangning group recovered to varying degrees， and the inflammatory infiltration was reduced. Compared with blank group， the levels of IL-1β， IL-6， IL-8， and TNF-α and protein expression of TLR-4， NF-κB and MyD88 in model group were significantly increased （P<0.01）， and the level of IL-2 significantly decreased （P<0.01）. Compared with model group， the levels of IL-1β， IL-6， IL-8， and TNF-α and protein expression of TLR-4， NF-κB and MyD88 in SASP group and Qilian Jiechangning group were significantly reduced （P<0.01）， and the IL-2 content was significantly increased （P<0.01）. Compared with SASP group， the expression of TLR-4 and MyD88 protein of Qilian Jiechangning group increased significantly （P<0.01）， the expression of NF-κB protein was significantly reduced （P<0.01）. Conclusion Qilian Jiechangning Decoction may inhibit the activity of TLR-4 protein and reduce the activation of the downstream NF-κB， thereby regulating the balance of pro-inflammatory and anti-inflammatory factors， reducing intestinal inflammation， thereby treating UC.159D5A1F-9B27-4AC8-8438-D29BA0CFF545

〔Keywords〕 ulcerative colitis; Qilian Jiechangning Decoction; inflammatory factor; Toll like receptor-4; myeloid differentiation factor 88; nuclear factor-κB

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis， UC），是一種臨床多發的特發性炎性腸病，好發于直腸和乙狀結腸的黏膜及黏膜下層，也可累及整段結腸[1-2]。除腹瀉、黏液膿血便及腹痛等主要癥狀外，還可伴有腹脹、惡心嘔吐、發熱、營養不良等癥狀，病情輕重不一，病程遷延反復。現代醫學認為，其發病機制可能是環境、遺傳、感染、腸道微生態及免疫因素相互作用所致[3]。由于其發病機制尚不明確，故無特效治療方案，臨床普遍采取保護腸黏膜、抗炎、清除致病源等對癥治療[4]。芪連結腸寧由黃芪、人參、炒白術、黃連、甘草等12味藥組成，實驗研究顯示其具有促進腸黏膜修復、健脾止瀉之功，臨床療效顯著[5-6]。本研究旨在探討芪連結腸寧對潰瘍結腸炎模型大鼠結腸組織中Toll樣受體-4（Toll like receptor-4， TLR-4）、核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB， NF-κB）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88， MyD88）蛋白表達及血清中相關炎癥因子的影響，以期為芪連結腸寧治療UC提供更深層次的科學依據。

1 材料與方法

1.1 ?動物

健康雄性SD大鼠48只，體質量（160±15） g，

2個月齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，光照時間12 h/d，室溫（25±3） ℃，相對濕度65%，噪音≤60 dB，適應性喂養1周后開始造模。所有關于實驗動物的操作均符合湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會規定，倫理審批號：2021-0088。

1.2 ?藥物

芪連結腸寧組成：黃芪15 g，人參15 g，炒白術15 g，陳皮10 g，黃連10 g，干姜6 g，蒲黃10 g，蒲公英15 g，敗醬草15 g，椿皮10 g，木香10 g，白芍15 g，甘草5 g。所有中藥材均購于湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房，藥物浸泡于蒸餾水中40 min，第1煎大火煮沸后，文火煎煮30 min;第2煎大火煮沸后，文火煎煮20 min，將2次煎煮湯藥混合濃縮制成含生藥1.27 g/mL的藥液，4 ℃冰箱內保存，使用前預熱。水楊酸柳氮磺胺吡啶（salicylazosulfapyridine， SASP），購自上海福達制藥有限公司（批號：22210903），用雙蒸水將濃度配成50 mg/mL的藥液，放入4 ℃冰箱內保存備用。

1.3 ?主要試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium， DSS，美國MP生物醫學公司，批號：S0849），水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號：20210489）;β-actin（北京博奧森生物技術有限公司，批號：AH11297476）;HRP-羊抗兔IgG、TLR4抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、特超敏增強型化學發光液均購自武漢博士德生物工程有限公司（批號分別為BST15H08A27H69、BST20315348、16H18B51、14E22B43）;MyD88抗體（英國Abcam公司，批號：ab2058）;NF-κB p56抗體（美國CST公司，批號：4612T3）;伊紅染液、蘇木素染液均購自武漢塞維爾生物科技有限公司（批號分別為ZH201285、ZH209148）;白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細胞介素-2（interleukin-2， IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒均購自美國R&D Systems公司（批號分別為R20210497、R20210512、R20210751、R20211101、R20210914）。

電泳系統、凝膠成像系統均購自美國Bio-RAD公司（型號分別為1658033、Gel Doc XR+）;石蠟切片機（德國徠卡公司，型號：RM2235）;BX43光學顯微鏡（日本Olympus公司，型號：IX73-U）;多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司，型號：Spectra Max 5）;高速冷凍離心機（日本日立公司，型號：CR22G Ⅱ）。

1.4 ?動物造模及分組

采用隨機數字表法將48只大鼠分為空白組、模型組、SASP組、芪連結腸寧組，每組12只。根據文獻[7-8]，采用3%DSS喂養建立UC大鼠模型。模型組、SASP組、芪連結腸寧組用蒸餾水配制濃度為3%的DSS溶液，放入飲水瓶中自由飲用，連續用藥7 d。空白組正常飲用水。按照Cooper評分系統[9]根據大鼠體質量減少、大便性狀、便血情況（每個項目根據癥狀嚴重程度依次計0～4分，得分越高，癥狀越嚴重）評定大鼠結腸組織疾病活動指數（disease activity index， DAI），DAI=（體質量減少分數+大便性狀分數+便血情況分數）/3，以DAI升高及大鼠結腸病理性改變視為造模成功。

1.5 ?干預方法

造模結束后的第2天起開始灌胃給藥。根據人臨床用量等效劑量和動物體表面積計算[10]，SASP組予SASP藥液0.27 g/kg，芪連結腸寧組予芪連結腸寧藥液3.5 g/kg，空白組和模型組予生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續28 d。159D5A1F-9B27-4AC8-8438-D29BA0CFF545

1.6 ?觀察指標

1.6.1 ?DAI評分 ?分別于治療前及治療第7、14、21、28天時觀察大鼠體質量變化，進食、活動及糞便情況，根據體質量下降、糞便性狀和隱血情況，計算DAI評分。

1.6.2 ?HE染色法觀察結腸組織形態 ?治療結束后第2天，大鼠經10%水合氯醛腹腔注射麻醉，立即暴露腹腔及胸腔，以生理鹽水行心臟灌注，待肝臟顏色變淡時停止灌注，快速取結腸組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，一部分放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察結腸組織形態。一部分存于-80 ℃冰箱內用于Western blot檢測。

1.6.3 ?ELISA法測定各組大鼠血清中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α含量 ?灌胃結束后第2天，各組的大鼠在行心臟灌注之前，先腹主動脈取血，4 ℃靜置4 h，

4 ℃、3500 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標儀在450 nm處讀取各孔吸光度，通過標準曲線計算每個樣品蛋白水平。

1.6.4 ?Western blot檢測結腸組織中TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達水平 ?取適量結腸組織冰上勻漿，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10min，收集上清液凍存于-80 ℃冰箱內備用。BCA法對蛋白定量。適量蛋白樣品進行電泳分離，5%濃縮膠60 V，10%分離膠90 V;然后濕轉90 min，電流300 mA，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗TLR-4、NF-κB（1∶1000）、MyD88（1∶500），4 ℃搖床過夜。次日，TBST緩沖液漂洗3次，二抗（1∶5000）室溫孵育90 min，TBST緩沖液漂洗3次，添加特超敏增強型化學發光液后在暗室中曝片。用Image J v1.8.0軟件分析各條帶灰度值，進行定量分析，統計各組與β-actin灰度值的比值。

1.7 ?統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件進行分析。實驗數據以“x±s”表示，組間數據比較采用ANOVA方差分析，用LSD法（方差齊）或Dunnetts T3（方差不齊）作組間多重比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ?各組大鼠治療前后一般情況觀察及體質量比較

空白組在治療前后毛色柔潤光澤，無稀便膿血便情況。造模第7天，造模各組少食懶動，抱團蜷縮，毛色枯槁，大便呈黏液狀，重者夾帶膿血，造模期間4只大鼠死亡（模型組2只、SASP組1只、芪連結腸寧組2只）。治療后，SASP組、芪連結腸寧組大便次數逐漸減少，膿血黏液便減少或消失，進食及飲水量增加，毛發逐漸恢復光澤。

治療前，各組體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。與空白組比較，模型組在治療第7、14、21、28天體質量均明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，SASP組及芪連結腸寧組在治療第14、21、28天體質量均明顯升高（P<0.05，P<0.01）。與SASP組比較，芪連結腸寧組在治療第7、14、21、28天體質量均明顯升高（P<0.05，P<0.01）。治療第7天，SASP組與芪連結腸寧組體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。詳見表1。

2.2 ?不同時間段各組大鼠DAI評分比較

治療前，除空白組外，其余各組大鼠DAI評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。治療第7、14、21、28天，SASP組和芪連結腸寧組DAI評分均明顯低于模型組（P<0.05，P<0.01）。與SASP組比較，芪連結腸寧組在治療第21天DAI評分明顯升高（P<0.05）。治療第7、14、28天，SASP組與芪連結腸寧組間DAI評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。詳見表2。

2.3 ?各組大鼠結腸組織形態學觀察

光鏡下觀察發現，模型組大鼠結腸組織出現明顯黏膜損傷，局部出現腺體排列紊亂和炎性細胞浸潤，腸壁增厚。SASP組及芪連結腸寧組結腸組織病理改變不同程度恢復，黏膜腺體排列較整齊，腸壁基本恢復，肌層病變減輕，炎性浸潤減輕。詳見圖1。

2.4 ?各組大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α含量比較

與空白組比較，模型組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量明顯升高（P<0.01），IL-2含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，SASP組、芪連結腸寧組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量明顯降低（P<0.01），IL-2含量明顯升高（P<0.01）。SASP組與芪連結腸寧組間IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。詳見表3。

2.5 ?各組大鼠結腸組織TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達比較

與空白組相比，模型組TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，SASP組、芪連結腸寧組TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達均明顯降低（P<0.01）。與SASP組相比，芪連結腸寧組TLR-4、MyD88蛋白表達均明顯升高（P<0.01），NF-κB蛋白表達明顯降低（P<0.01）。詳見圖2。

3 討論

UC屬于難治性疾病之一，目前常用的西藥主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質激素等，以上藥物在單獨或結合使用時都存在不同程度的不良反應，且減少或停用藥物時有極大的復發或加重病情的風險。相比較而言，傳統中醫治療慢性炎性消化系統疾病具有獨特優勢。UC屬中醫學“泄瀉”“腸澼”“痢疾”“內瘍”范疇[11]，一般認為素體脾胃虛弱為發病基礎，感受外邪和飲食、情志失調為其誘導因素，濕、熱、瘀、毒、痰等郁結大腸，氣血凝滯，腸絡損傷，壅為膿血，遂發此病[12]。經過長期實驗和臨床研究表明，芪連結腸寧治療UC確有療效，方中人參、炒白術、黃芪、陳皮補氣健脾祛濕，黃連、干姜辛開苦降、寒溫并用，蒲黃、蒲公英、敗醬草、椿皮清熱活血、澀腸祛瘀，木香調理腸道氣機，白芍酸甘斂陰止痛，甘草調和諸藥，全方共奏補脾健胃祛濕、活血拔腐生新、收斂固澀止瀉之功效[5-6，13-14]。現代藥理研究結果顯示，芪連結腸寧中某些單味中藥對于治療UC具有重要意義。黃連對于急慢性炎癥均有很好的抑制作用，可通過抑制炎性通路的活化，減少炎癥因子的表達，起到抗炎作用[15];其中小檗堿類是黃連所含生物堿中最豐富且最具代表性的化合物，它可通過抑制炎癥因子IL-1β，TNF-α的增加，抑制回腸TLR-4和NF-κB的活化，從而減輕腸道的炎癥反應，還可通過抑制H+-K+-ATP酶活性，抑制胃酸分泌，保護胃黏膜[16]。人參因具有大補元氣、補脾益肺等功效而廣為人知，人參中的人參皂苷Rg5在機體內代謝成為人參皂苷Rh3，其對于脂多糖刺激的小膠質細胞具有抗炎作用，還具有很好的抗腫瘤、抗氧化及抗凋亡等藥理作用[17-18]。通過體內外研究發現，蒲公英通過抑制炎癥反應相關的細胞及趨化因子的表達，起到抗炎抗氧化作用，有效預防和緩解自身免疫性炎癥疾病[19];在急/慢性胃潰瘍大鼠模型中，蒲公英提取物可以緩解腸道炎癥狀態，保護胃黏膜[20]。總之，基于中醫理、法、方、藥基本內涵和現代藥理學研究進展，芪連結腸寧治療UC具有完備的理論和科學數據支持。本實驗中UC模型大鼠體質量明顯下降，DAI評分明顯升高且結腸組織發生明顯病理改變，提示造模成功。經過4周的干預治療，SASP組、芪連結腸寧組大鼠一般情況明顯好轉，體質量明顯增加，DAI評分明顯降低且結腸組織病理改變明顯減輕，提示芪連結腸寧可改善UC模型大鼠的生存質量及腸道的病理性改變，與既往研究結果基本一致[5，14]。159D5A1F-9B27-4AC8-8438-D29BA0CFF545

研究顯示，TLR-4/MyD88/NF-κB通路的活化是誘發UC發病的最重要信號通路之一[21]。在TLR-4信號通路傳導的過程中，MyD88是重要的接頭蛋白，MyD88 C端TIR結構域與TLR-4的TIR結構域相結合，而MyD88的N端的死亡區域與NF-κB相結合，激活NF-κB促使下游相關促炎因子大量釋放，從而介導UC腸道黏膜免疫反應[22]。YANG等[23]研究發現，TLR-4/MyD88/NF-κB信號通路是調節UC患者腸道炎癥反應的重要通路，抑制TLR-4/MyD88/NF-κB信號通路表達可以降低腸道炎癥反應，改善患者預后。本次實驗結果顯示，模型組大鼠結腸組織TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達顯著升高（P<0.01），SASP組、芪連結腸寧組大鼠結腸組織中TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達明顯降低（P<0.01），提示芪連結腸寧可通過調節NF-κB信號通路而發揮對UC的治療作用。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α是重要的促炎癥細胞因子，IL-2為抗炎細胞因子，抗炎與促炎因子動態失衡與炎性腸病的發生和發展密切相關[24]，通過檢測血清中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平可判斷病情進展及免疫功能恢復情況[25]。IL-1β、IL-6和IL-8是機體重要的前炎癥因子，可以促進T細胞和B細胞活化，誘導多種炎癥細胞因子釋放，加重UC患者腸道組織損傷[26]。TNF-α是機體最重要的促炎因子之一，可以直接殺傷或抑制靶細胞，還可以激活機體的NF-κB信號通路，增加促炎因子的表達，誘導全身炎癥反應，推進疾病惡性進展[27]。IL-2是一種重要的免疫應答調控因子，在缺乏IL-2或其受體（IL-2-/-和CD25-/-）的小鼠，以及缺乏IL-2下游信號分子（JAK3-/-和STAT5-/-）的小鼠中，調節性T細胞不發育，并發生以活化的CD4+T細胞增多、自身抗體產生和炎性腸病等為特點的自身免疫疾病[28]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平明顯升高，抗炎因子IL-2水平明顯降低，SASP組、芪連結腸寧大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均不同程度降低，IL-2水平明顯升高，提示芪連結腸寧能一定程度上抑制機體的炎癥反應，糾正機體抗炎因子與炎癥因子的失衡。

綜上所述，芪連結腸寧能顯著改善UC模型大鼠結腸組織病理炎癥性損傷，降低TLR-4、NF-κB、MyD88蛋白表達，抑制血清促炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，上調抗炎細胞因子IL-2水平，表明芪連結腸寧可能通過調控TLR-4/MyD88/NF-κB炎癥信號通路而發揮對UC的治療作用，其機制可能是通過抑制TLR-4蛋白活性，減少其下游的NF-κB的活化，進而調控促炎和抗炎因子的平衡，減少腸道炎癥反應。

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