基于網絡藥理學及分子對接探討半夏-藿香抗新型冠狀病毒肺炎作用機制

滕龍飛 陳佳麗 王鎵 周慶偉

摘要 目的：基于網絡藥理學篩選半夏-藿香藥對治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的潛在活性成分、核心靶點、信號通路。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）篩選半夏-藿香藥對活性成分和靶點，與GeneCards、NCBI數據庫中COVID-19基因集相互映射獲取關鍵靶點，同時通過STRING數據庫和Cytoscape 3.6.1軟件構建關鍵靶點相互作用網絡。利用DAVID數據庫進行基因本體（GO）-生物過程（BP）及KEGG通路富集分析，獲得分子對接證據支持。結果：半夏-藿香藥對有效活性成分24個，關鍵靶點45個，共富集出生物過程、細胞組分和分子功能條目443條，通路103條。分子對接結果顯示在半夏-藿香藥對中，與3CLpro結合最好的是β-谷甾醇;與血管緊張素轉換酶2結合最好的為槲皮素。結論：半夏-藿香藥對關鍵化合物可能從結構上作用于嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）入侵及從多成分多靶點多通路抑制細胞因子風暴，廣譜抗病毒、抑菌及免疫調節，干預網狀激活系統起到治療作用。

關鍵詞 半夏-藿香藥對;網絡藥理學;新型冠狀病毒肺炎;分子對接

Mechanism of Pinelliae Rhizoma-pogostemonis Herba Against COVID-19 Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

TENG Longfei1，CHEN Jiali1，WANG Jia1，ZHOU Qingwei2

（1 Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China; 2 The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China）

Abstract Objective：To screen the potential active components，core targets，and signaling pathways of Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba for the treatment of Coronavirus Disease 2019（COVID-19） based on network pharmacology.Methods：The active components and targets of Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba were screened out by the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the key targets were obtained by mutual mapping with COVID-19 gene sets in GeneCards and NCBI.Meanwhile，the key target interaction network was constructed by STRING and Cytoscape 3.6.1.Enrichment analysis of Gene Ontology（GO）-biological process（BP） and KEGG pathways was performed using DAVID，which was supported by molecular docking evidence.Results：There were 24 active components and 45 key targets of Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba，443 entries of biological processes，cellular components，and molecular functions，and 103 pathways.Molecular docking results showed that in Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba，β-sitosterol and quercetin showed best binding to 3CLpro and angiotensin-converting enzyme 2（ACE2），respectively.Conclusion：The key compounds of Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba may structurally act on the invasion of the severe acute respiratory syndrome（SARS）-CoV-2 and inhibit cytokine storm from multiple components，multiple targets，and multiple pathways.Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba exert the therapeutic role by virtue of broad-spectrum antiviral，antibacterial，immunomodulatory effects and intervening in the reticular activation system.

Keywords Pinelliae Rhizoma-Pogostemonis Herba; Network pharmacology; COVID-19; Molecular docking328914AB-F61E-4124-8E19-47EC583A36D2

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.002

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），是由嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染導致的急性呼吸道傳染疾病[1]。其主要通過飛沫、密切接觸及糞口傳播，臨床癥狀以發熱、干咳或咳痰、呼吸困難為主，可伴惡心、乏力和腹瀉等癥狀，病情進展可能促使急性呼吸窘迫綜合征、呼吸衰竭、凝血障礙、甚至休克等嚴重并發癥的產生[2]，中位潛伏期為4 d[3]。目前針對新冠病毒尚無特效藥，尋找安全、有效的治療藥物是當前研究工作的關鍵[4]。

COVID-19屬中醫“疫病”范疇，病因為感受“疫戾”之氣;中醫治療COVID-19，在用藥歸經上，肺、胃、脾3經的使用頻率最高，“溫邪上受，首先犯肺”，疫戾之氣從口鼻而入[5]，肺開竅于鼻，脾開竅于口，疫戾之邪遂客于肺，傳于脾胃[6]。COVID-19處方中的核心藥物組合半夏-藿香藥對共出現32次，排在核心藥對第4位[7]。藿香芳香化濕，半夏燥濕化痰，降逆止嘔，二藥配伍即可調氣治肺，亦可祛濕醒脾，在最新版診療方案中均可見二者配伍。

1 材料與方法

1.1 篩選半夏-藿香藥對的有效成分及靶基因 以“半夏”“藿香”為關鍵詞，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）查找半夏-藿香藥對的化學成分及對應靶蛋白。通過UniProt數據篩選出物種為“Homo sapiens”的靶點蛋白用基因表示，最終得到潛在成分的基因靶點。

1.2 獲取疾病基因 基于NCBI、GeneCards平臺，以“Novel Coronavirus Pneumonia”為檢索詞，篩選COVID-19相關基因。

1.3 半夏-藿香藥對作用靶點預測 通過Venny2.1平臺，將半夏-藿香靶點與COVID-19靶點相映射。

1.4 構建“藥物-成分-靶點”網絡 利用Cytoscape 3.6.1構建網絡。在網絡中，節點（Node）代表（半夏-藿香）、藥物活性成分、關鍵靶基因。邊（Edge）代表（半夏-藿香）與對應活性成分、活性成分與靶基因相互作用關系。

1.5 構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡 將映射后的靶點蛋白導入STRING數據庫，設置高置信度，利用Cytoscape 3.6.1構建PPI網絡，獲取拓撲參數。

1.6 基因富集分析 運用DAVID6.8富集分析交集基因所涉及的基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析-生物過程（Biological Process，BP）和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并利用R語言可視化。

1.7 分子對接 為了支撐預測的可靠性，進行分子對接。通過PDB數據庫下載SARS-CoV-2靶點蛋白血管緊張素轉換酶（Angiotensin-converting Enzyme，ACE）2（PDB ID：1r42）、3CLpro（PDB ID：6lu7）分子結構，利用Pymol軟件刪除水和配體，通過AutoDock軟件加氫后保存成pdbqt文件，通過ZINC15（http：//zinc.docking.org/）獲取臨床常用抗病毒藥Ribasphere（ZINC1035331）作為對照，利用Autodock Vina把ACE2、3CLpro受體與關鍵成分小分子配體進行分子對接，篩選結合能最低的結構為最優結構。

2 結果

2.1 半夏-藿香藥對治療COVID-19潛在靶標 根據篩選條件得到半夏-藿香活性化合物共24個。見表1。刪除重復后共預測靶標200個;其中半夏有效成分13個，預測靶點86個;藿香有效成分11個，預測靶點164個。

2.2 獲取COVID-19潛在基因 剔除重復基因，共獲得潛在基因259個。

2.3 半夏-藿香治療COVID-19靶點預測 映射共得到45個交集靶點。見圖1。

2.4 構建“藥物-成分-靶點”網絡 共篩選出半夏-藿香藥對24個活性化合物和200個靶點。見圖2。其中，根據“Degree”值大小排名前8個化合物包括Quercetin（槲皮素）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）、Baicalein（黃芩素）、Irisolidone（鳶尾酮）、Cavidine（卡維丁）、Stigmasterol（豆甾醇）、Coniferin（松柏苷）、Genkwanin（芫花素），其中“Degree”值最大的為槲皮素，其涉及靶點最多，說明其作用效果可能最顯著。

2.5 構建PPI網絡 PPI網絡共涉及45個節點、302條邊，節點Degree值>13.4（均值）的核心靶蛋白共20個。見圖3。其中節點大小代表度值，邊粗細代表連接評分，Degree值越大代表其作用越關鍵，其可能是半夏-藿香藥對治療COVID-19的關鍵靶蛋白。通過PPI網絡分析得知TNF、IL-6、IL-1β、MAPK1、TP53、RELA、IL-10、CXCL8、CCL2、MAPK14等靶點是半夏-藿香藥對治療COVID-19的主要作用靶點。328914AB-F61E-4124-8E19-47EC583A36D2

2.6 基因富集分析 共富集出生物學過程、細胞組分和分子功能條目443條。以P<0.01為篩選條件，獲得GO-BP過程361條，KEGG通路103條。選取排名前20的GO-BP條目及KEGG通路繪制氣泡圖。見圖4。其中涉及炎癥反應、細胞對脂多糖的反應、對藥物的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、免疫反應、凋亡過程、轉錄的正調控DNA模板、凋亡過程的負調控、核因子κB活性的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、對抗生素的反應等生物學過程，在甲型流感、百日咳、結核、癌癥、瘧疾等通路富集較集中。

2.7 半夏-藿香藥對核心成分的分子對接驗證 半夏-藿香藥對治療COVID-19的關鍵靶點主要集中在槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、芫花素，故選取其作進行分子對接以驗證預測結果。一般認為結合能越低構象越穩定，分子對接結果顯示，槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、芫花素均能較好地與ACE2、3CLpro結合，結合能均小于抗病毒藥Ribasphere。見表2。與ACE2結合最好的為槲皮素（結合能為-7.8 kcal/mol）（1 kcal=4.184 kJ）。見圖5 A-C。與3CLpro結合最好的是β-谷甾醇（結合能為-7.5 kcal/mol）。見圖5D-F。

3 討論

目前新冠病毒尚無特效藥，我國中西醫結合防治COVID-19取得了一定成績，目前疫情已基本控制，在新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）中在各個治療時期始終注重祛濕，而半夏-藿香藥對又貫穿始終，均可見二者配伍。本研究利用網絡藥理及分子對接從痰濕角度探尋半夏-藿香藥對治療COVID-19的潛在機制，共篩選出半夏-藿香藥對24個活性化合物和200個靶點。其中，根據“Degree”值大小排名前8個化合物包括Quercetin（槲皮素）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）、Baicalein（黃芩素）、Irisolidone（鳶尾酮）、Cavidine（卡維丁）、Stigmasterol（豆甾醇）、Coniferin（松柏苷）、Genkwanin（芫花素），其中“Degree”值最大的為槲皮素，說明其作用效果最顯著。有研究表明槲皮素具有抗炎抑菌、抗病毒、抗氧化的藥理活性[8]，可以抑制中東呼吸綜合征-冠狀病毒（Middle East Respiratory Syndrome-coronavirus，MERS-CoV）3C樣蛋白酶的活性[9]。β-谷甾醇具有良好的抗氧化、抗炎、免疫調節等藥理活性[10]。有研究顯示，β-谷甾醇可防止肺組織組織病理學中的氣道炎癥[11]。豆甾醇屬植物甾醇，具有抗炎退熱、降膽固醇、抗癌作用[12]。黃芩素具有抗病毒、抗炎、抗補體的作用[13]。卡維丁可通過抑制炎癥介質腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-6的產生以及核因子κB信號通路的激活，預防和治療急性肺損傷等肺炎性疾病[14]。鳶尾酮是一種異黃酮代謝物，具有抗病毒作用，研究發現鳶尾酮通過抑制人膠質細胞中TATA（T胸腺嘧啶，A腺嘌呤）框Sp1-Ⅱ的結合來抑制JC病毒的基因表達[15]。芫花素對目前在中國和歐洲流行的高毒力非洲豬瘟病毒分離株顯示出有效的抗病毒活性，強調了其作為抗病毒藥物候選開發的價值[16]。

半夏-藿香藥對的靶點類型眾多，篩選出核心靶點共20個。通過PPI網絡分析得知腫瘤壞死因子、白細胞介素6、白細胞介素1β、促分裂原活化蛋白激酶1、腫瘤蛋白P53、RELA、白細胞介素10、趨化因子C-X-C基序配體（Chemokine（C-X-C Motif）Lligand，CXCL）8、CC趨化因配體（CC Chemokine Ligand，CCL）2、促分裂原活化蛋白激酶14等靶點是半夏-藿香藥對治療COVID-19的主要作用靶點。COVID-19與嚴重急性呼吸綜合征和MERS-CoV感染都由β-冠狀病毒引起[17]。早期研究表明，嚴重急性呼吸綜合征患者血清中炎癥介質白細胞介素1β，白細胞介素6，白細胞介素12，γ干擾素，誘導蛋白10和單核細胞趨化蛋白（Monocyte Chemoattractant Protein，MCP）1的含量增加。感染MERS-CoV病毒促使機體炎癥介質γ干擾素、腫瘤壞死因子α、白細胞介素15、白細胞介素17的含量增多。而COVID-19患者體內炎癥介質白細胞介素1β、γ干擾素、誘導蛋白10、MCP1增多，可能是Th1細胞反應的原因[18]。半夏-藿香藥對中腫瘤壞死因子、白細胞介素6、白細胞介素1β、CXCL8炎癥介質與白細胞介素10抗炎因子相互作用，可能是抑制中性粒細胞趨化蛋白發生細胞因子風暴，進而引起急性呼吸窘迫綜合征的重要靶點[19-20]。促分裂原活化蛋白激酶1和促分裂原活化蛋白激酶14是絲裂原活化蛋白激酶家族成員，它們可在氧化應激、病毒感染的應激下被激活[21]。CCL2在促炎性刺激（如白細胞介素-8、腫瘤壞死因子-α）或病毒等病理性條件下形成，通過促炎反應和免疫應答等反應可以促使免疫細胞到達感染部位[22]。

半夏-藿香藥對治療COVID-19靶點GO生物過程富集涉及炎癥反應、免疫反應、凋亡過程、核因子κB轉錄因子活性的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控、對抗生素的反應等，這些生物過程在半夏-藿香藥對治療新型冠狀病毒肺炎中起到了關鍵作用。通過KEGG富集分析可知，半夏-藿香藥對主要活性成分靶點涉及參與甲型流感、百日咳、結核、癌癥、瘧疾等途徑，參與腫瘤壞死因子、Toll樣受體、缺氧誘導因子-1、核苷酸結合寡聚化結構域（Nucleotide Binding Oligomerization Domain，NOD）樣受體（NOD-like Receptor，NLR）等信號通路作用于COVID-19。人體免疫系統激活后，T細胞分化釋放白細胞介素6、白細胞介素1β、腫瘤壞死因子等炎癥介質參與免疫過程[23]。有研究發現抑制缺氧誘導因子-1α可以降低腫瘤壞死因子-α和白細胞介素的表達，表明缺氧誘導因子-1α在炎癥介質的分泌起關鍵作用[24]。各種Toll樣受體參可調節病毒復制，進而影響病毒的發病[25]。328914AB-F61E-4124-8E19-47EC583A36D2

綜上所述，半夏-藿香藥對治療COVID-19可能的有效成分是槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、芫花素等，可能通過上述多靶點、多通路，從結構上作用于SARS-CoV-2入侵，抑制細胞因子風暴，共同參與抗病毒、抑菌、免疫調節，干預腎素-血管緊張素系統起到治療作用。本研究具有一定局限性，有待實驗進一步驗證。

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（2020-08-15收稿 本文編輯：魏慶雙）328914AB-F61E-4124-8E19-47EC583A36D2