土田七醇提物抑制肝癌細胞增殖活性部位篩選及其對肝癌細胞侵襲遷移的影響

陳成 劉毅 許漢林

〔摘要〕 目的 篩選土田七醇提物抗肝癌活性部位，并研究其對肝癌SMMC-7721細胞和HepG2細胞侵襲遷移的影響。方法 采用大孔樹脂對土田七醇提物進行洗脫，并采用CCK-8法檢測不同洗脫部位對肝癌細胞增殖的影響;建立荷瘤小鼠模型，通過瘤體質量變化評價不同洗脫部位的體內抗腫瘤作用;采用Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗檢測肝癌細胞侵襲遷移能力。結果 土田七醇提物的大孔樹脂不同洗脫部位均有抑制肝癌細胞增殖的作用，并可抑制裸鼠腫瘤的生長，其中70%洗脫部位的效果最好。Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗結果顯示，70%洗脫部位可抑制肝癌細胞侵襲和遷移過程。結論 土田七醇提物的大孔樹脂70%洗脫部位抗肝癌活性最好，并可抑制肝癌細胞侵襲遷移能力。

〔關鍵詞〕 土田七;肝癌;醇提物;活性部位;侵襲;遷移

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.010

Screening of active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus and its

effect on invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

CHEN Cheng， LIU Yi， XU Hanlin*

（Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China）

〔Abstract〕 Objective To screen the anti-hepatocellular carcinoma active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus， and investigate its effect on invasion and migration of SMMC-7721 and HepG2. Methods The alcohol extract of Stahlianthus involucratus was eluted by macroreticular adsorbents， followed by the CCK-8 to investigate the hepatocellular carcinoma cell proliferation treated by the different fractions. The tumor bearing mouse model was established and used to screen the antitumor effect in vivo with different fractions by the changes of the weight of tumor mass. The invasion and migration abilities of hepatocellular carcinoma cells were detected by Transwell chamber assay and scratch assay. Results Different fractions of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus can inhibit the multiplication of hepatocellular carcinoma cells and inhibit the growth of tumor in nude mice. Among them， the fraction eluted with 70% ethanol has the best effect. Both Transwell chamber assay and scratch assay results showed that the fraction eluted with 70% ethanol can inhibit the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Conclusion The 70% elution fraction of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus has the best anti-liver cancer activity， which also could inhibit the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

〔Keywords〕 ?Stahlianthus involucratus; hepatocellular carcinoma; alcohol extract; active fraction; invasion; migration

肝癌是我國臨床上常見的惡性腫瘤之一，由于其具有極強的侵襲轉移能力，導致中晚期肝癌的死亡率仍然居高不下[1-5]。研究表明，約60%以上的患者在接受手術治療后的5年內會出現復發和轉移[6-9]。因此，探索抑制肝癌細胞侵襲遷移能力的方法是目前肝癌研究的熱點之一，而姜科藥用植物在抗腫瘤研究中的進展給人們提供了新的思路和策略。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

土田七是姜科土田七屬植物土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]的干燥塊根和根莖，中醫學認為其具有活血止血、消腫散瘀的功效[10-11]。現代研究表明，土田七對多種類型的腫瘤細胞具有抑制和殺傷作用[12-14]。但目前土田七對肝癌SMMC-7721和HepG2細胞侵襲遷移的影響尚未見報道。本實驗通過體內外抗肝癌藥理試驗，篩選出土田七醇提物抗肝癌活性最強的大孔樹脂洗脫部位，并觀察其對肝癌細胞侵襲遷移的影響，為土田七抗癌作用的研究提供實驗基礎和研究依據。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?細胞株與實驗動物 ?肝癌細胞株SMMC-7721（上海翼和應用生物技術有限公司，批號：20180412-

01）和HepG2（上海信裕生物科技有限公司，批號：XY0022）。昆明小鼠（雄性，4～6周;體質量18～22 g），購自湖北省實驗動物研究中心。動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 ?藥材與試劑 ?藥材購自云南省文山州，經湖北中醫藥大學的陳科力教授鑒定為土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]。姜黃素標準品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，貨號：B20614）;DMEM細胞培養基（美國HyClone公司，批號：8118269）;胎牛血清（武漢四季青生物制品公司，批號：18040502）;胰蛋白酶消化液（美國Gibco公司，批號：2323527）;PBS （美國HyClone公司，批號：AG29574691）;Annexin V -FITC/PI檢測試劑盒（上海貝博生物技術公司， 批號：BB21061）;Matrigel基質膠（美國BD公司，批號：7156009）。

1.1.3 ?主要儀器 ?SW-CJ-2G型超凈工作臺（蘇州凈化工作臺設備有限公司）;INCO108型二氧化碳培養箱（德國Memmert公司）;xMark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;L530R型低溫離心機（湖南湘儀離心機有限公司）;D2060R型流式細胞儀（艾森生物有限公司）;CKX53型倒置相差顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?土田七醇提物的制備 ?稱取洗凈的土田七1 kg，粉碎過篩，75%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，過濾濃縮，冷干成粉備用。

1.2.2 ?大孔樹脂柱各洗脫部位的制備 ?稱取D101大孔吸附樹脂適量，預處理后，濕法裝柱。將土田七醇提物用適量水溶解，上樣。依次用水溶液、30%乙醇溶液、70%乙醇溶液、95%乙醇溶液進行洗脫。收集各洗脫液，并減壓濃縮至干粉狀。各乙醇洗脫部位以DMSO復溶后，制成0.1 g/mL（以提取物計）的原液，0.22 μm濾膜過濾，-20 ℃保存。

1.2.3 ?檢測土田七各洗脫部位對肝癌細胞增殖的影響 ?取對數期生長的SMMC-7721細胞、HepG2細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，每孔100 μL加入96孔板中，置于培養箱（37 ℃、5% CO2）中培養24 h。將細胞隨機分組，姜黃素組和30%、70%、95%乙醇洗脫組分別設置5個不同給藥濃度（20、40、60、80、100 μg/mL），同時設置陰性對照組（含細胞，加入等體積培養基）和空白對照組（不含細胞，只含培養基），每組復孔5個。加藥后繼續培養24 h。藥物處理結束后，加入含10% CCK-8試劑的細胞培養基，混勻后置于培養箱中繼續培養3 h，在450 nm波長下檢測各培養孔的吸光度（A）值，并計算肝癌細胞的細胞活力[細胞活力=（A給藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%]。

1.2.4 ?肝癌細胞移植瘤小鼠模型的建立及分組給藥

取對數期生長的SMMC-7721細胞懸液和HepG2細胞懸液，分別調整細胞濃度為1×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。培養5～7 d后，無菌條件下抽取小鼠腹水，調整細胞懸液濃度為2×106/mL，每只小鼠0.2 mL接種至右腿皮下部位。接種完成后，按隨機原則將兩種肝癌細胞的已成模小鼠各分為5組，每組6只。分組情況如下：空白對照組、姜黃素組及30%、70%、95%乙醇洗脫組。空白對照組給予生理鹽水灌胃，0.5 mL/d;姜黃素組和各乙醇洗脫組給藥劑量均為100 mg/（kg·d），連續灌胃給藥14 d。給藥結束后，完整剝離小鼠的皮下移植瘤，并稱取腫瘤質量。

1.2.5 ?Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 ?將基質膠用不含血清的培養基稀釋，加入Transwell小室，于培養箱中靜置1 h使基質膠凝固。取藥物預先處理24 h的肝癌細胞，調整細胞濃度為2×105/mL，均勻接種至Transwell小室中。小室中加入600 μL的含血清培養基，培養24 h后，取出小室，清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定細胞20 min，將小室浸泡在結晶紫染液中染色10 min，再次清洗并擦去上室內殘留的細胞。晾干后，倒置顯微鏡下拍照，200倍下隨機選取5個視野進行細胞計數。

1.2.6 ?劃痕實驗檢測細胞遷移能力 ?取對數生長期的肝癌細胞制成細胞懸液，并接種于6孔板，每孔5×105個細胞，待細胞覆蓋率達90%時，用10 μL 移液槍槍頭垂直于孔板畫線。用PBS清洗2～3次，洗掉懸浮的細胞。加入含有藥物的培養基，在培養箱中繼續培養，于0 h和24 h時，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。劃痕面積=（0 h空白對照組劃痕面積減號24 h 給藥組劃痕面積）/（0 h空白對照組劃痕面積）×100%。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

1.2.7 ?統計學分析 ?使用GraphPad Prism 7統計軟件進行分析，計量資料數據以“x±s”表示，兩組間的比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 ?大孔樹脂柱各洗脫部位抑制肝癌細胞增殖

測定各給藥組的細胞活力，結果見圖1。各洗脫部位中，70%乙醇洗脫組抑制肝癌細胞增殖的效果最佳，且存在顯著的量效關系。70%乙醇洗脫組與姜黃素組相比較，差異無統計學意義（P>0.05），與30%、95%乙醇洗脫組相比較，存在顯著性差異（P<0.01）。

2.2 ?大孔樹脂柱各洗脫部位對小鼠移植瘤生長的影響

比較各給藥組的瘤重，結果見圖2。在SMMC-7721模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.023 8）;95%乙醇洗脫組與空白對照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.031 4）。在HepG2模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.0324）;95%乙醇洗脫組與空白對照組比較，平均瘤重有顯著性差異（P=0.038 8）。與空白對照組相比較，30%乙醇洗脫部位對小鼠的瘤重無明顯影響。

2.3 ?土田七抗肝癌活性部位對肝癌細胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實驗發現，用70%乙醇洗脫部位（20 μg/mL）處理肝癌SMMC-7721和HepG2細胞24 h后，與空白對照組相比，土田七能明顯降低肝癌SMMC-7721和HepG2細胞侵襲的能力。詳見圖3。

2.4 ?土田七抗肝癌活性部位對肝癌細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，70%乙醇洗脫組（20 μg/mL）對肝癌SMMC-7721和HepG2細胞的遷移能力具有明顯的抑制作用。在SMMC-7721模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對照組比較，劃痕面積有顯著性差異（P=0.0385）。在HepG2模型組中，70%乙醇洗脫組與空白對照組比較，劃痕面積有顯著性差異（P=0.021 3）;詳見圖4。

3 討論

臨床上，手術治療依然是提高肝癌治療效果的主要手段，但除少數早期患者外，大部分患者因為肝癌細胞的轉移而失去了手術機會。即便接受了手術治療，在后期也有較大概率發生轉移及復發，導致患者的5年存活率尚不及30%[15-20]。鑒于此，對能夠抑制肝癌侵襲遷移的藥物進行探索和研究具有重要的現實意義。本研究通過體內外抗腫瘤實驗對土田七醇提物的大孔樹脂洗脫部位進行了活性篩選，通過實驗數據的分析，發現70%乙醇洗脫部位的抗腫瘤活性最佳，其次是95%乙醇洗脫部位，30%乙醇洗脫部位則無明顯的抗腫瘤效果。因此，本實驗以70%乙醇洗脫部位為基礎，進一步探究其是否具有抑制肝癌細胞侵襲遷移的能力。為了排除藥物通過誘導細胞凋亡對侵襲遷移的影響，此次采用了對肝癌細胞增殖率影響較小的藥物濃度（20 μg/mL）進行了后續的Transwell侵襲實驗和細胞劃痕實驗。實驗結果表明，70%乙醇洗脫部位對兩種人肝癌細胞株SMMC-7721和HepG2的侵襲遷移能力均具有顯著的抑制作用。本研究為姜科植物土田七的開發利用和肝癌的臨床治療提供了實驗依據和理論基礎，隨著研究的深入，土田七在肝癌的臨床防治上將會有更廣泛的作用。

參考文獻

[1] BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries： global cancer statistics 2018[J]. CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2018， 68（6）： 394-424.

[2] 安 ?瀾，曾紅梅，鄭榮壽，等.2015年中國肝癌流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019，41（10）：721-727.

[3] EUROPEAN ASSOCIATION FOR THE STUDY OF THE LIVER ELECTRONIC ADDRESS： EASLOFFICE@EASLOFFICE EU， EUROPEAN ASSOCIATION FOR THE STUDY OF THE LIVER. EASL clinical practice guidelines： Management of hepatocellular carcinoma[J]. Journal of Hepatology， 2018， 69（1）： 182-236.

[4] 黃 ?成，孫惠川.中晚期肝癌的根治之路：轉化治療[J].臨床外科雜志，2021，29（11）：1008-1011.

[5] LI D， YU T， HU J J， et al. Downregulation of CYP39A1 serves as a novel biomarker in hepatocellular carcinoma with worse clinical outcome[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2021， 2021： 5175581.

[6] CHEN W Q， ZHENG R S， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2016， 66（2）： 115-132.81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

[7] AL-SALAMA Z T， SYED Y Y， SCOTT L J. Lenvatinib： A review in hepatocellular carcinoma[J]. Drugs， 2019， 79（6）： 665-674.

[8] MOSSENTA M， BUSATO D， BABOCI L， et al. New insight into therapies targeting angiogenesis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancers， 2019， 11（8）： E1086.

[9] 孫 ?萌，邵 ?亮，劉 ?攀，等.姜黃素聯合順鉑對HepG2肝癌細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響[J].中華實驗外科雜志，2017，34（5）：774-776.

[10] 高江云，夏永梅，黃加元，等.中國姜科花卉[M].北京：科學技術出版社，2006：107.

[11] 國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草，第8冊，24卷[M].上海：上海科技出版社，1999：6231.

[12] 曾立威，唐春燕，徐 ?勤.三七姜揮發油成分的GC-MS分析與體外抗腫瘤活性研究[J].華夏醫學，2017，30（4）：33-38.

[13] 于 ?政，鄭雪絨，趙亞寧，等.姜三七對子宮肌瘤大鼠子宮組織細胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響[J].現代生物醫學進展，2017，17（35）：6921-6924，6991.

[14] 駱宇燊.土田七抗腫瘤作用及其機制研究[D].武漢：湖北中醫藥大學，2020.

[15] CERVELLO M， EMMA M R， AUGELLO G， et al. New landscapes and horizons in hepatocellular carcinoma therapy[J]. Aging， 2020， 12（3）： 3053-3094.

[16] CHEN Z Q， XIE H， HU M M， et al. Recent progress in treatment of hepatocellular carcinoma[J]. American Journal of Cancer Research， 2020， 10（9）： 2993-3036.

[17] 王潤兮，劉培民，高劍鋒.中西醫治療原發性肝癌的研究進展[J].中醫臨床研究，2020，12（33）：56-60.

[18] 何正陽，商斌儀，佘為民，等.中藥聯合TACE治療原發性肝癌療效的系統評價[J].肝臟，2020，25（12）：1262-1268，1281.

[19] 郭 ?麗，趙 ?虹，張俊濤，等.白花丹素通過調控Wnt信號通路抑制肝癌MHCC97-H細胞增殖、遷移和侵襲[J].中國老年學雜志，2021，41（24）：5635-5639.

[20] HIRAOKA A， KUMADA T， KUDO M， et al. Hepatic function during repeated TACE procedures and prognosis after introducing sorafenib in patients with unresectable hepatocellular carcinoma： Multicenter analysis[J]. Digestive Diseases （Basel， Switzerland）， 2017， 35（6）： 602-610.81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42