細基江蘺繁枝變種原生質體制備條件優化

何藝賓，郝 華

(1.廈門海洋職業技術學院海洋生物學院，福建 廈門 361100；2.廈門大學海洋生物制備技術國家地方聯合工程實驗室，福建 廈門 361104)

江蘺屬(Gracilaria)海藻是一種重要的大型海洋經濟藻類，其藻體富含藻膠，是提取工業用瓊膠的主要原料[1]。細基江蘺繁枝變種(Gracilariatenuistipitatavar.liui Zhang et Xia)俗稱細江蘺(Gracilariacrinale)[2]，以其提取的瓊膠經濟價值大，而被廣泛應用于食品工業和醫藥衛生等領域[3]。此外，細基江蘺繁枝變種是鮑魚的優質餌料[4]，在福建東山島許多鮑魚養殖場曾用這一品種喂養鮑魚，引發市場供不應求，價格一度走俏，養殖經濟效益顯著。然而在細江蘺繁枝變種人工養殖過程中容易出現藻種老化、藻體染病和不耐高溫等問題[5]，因此對細基江蘺繁枝變種進行品種改良勢在必行。

原生質體作為受體材料，已被廣泛應用于植物基因功能研究和雜交育種等[6-7]。目前研究發現紅藻的原生質體能夠分化再生成新的藻體。Lafontaine N等[8]從帶形蜈蚣藻(Grateloupiaturuturu)分離獲得了原生質體，并通過培養獲得了再生藻體；Yeong H Y等[9]從張氏江蘺(Gracilariachangii)中分離獲得了原生質體并通過培養也獲得了再生江蘺。原生質體作為轉基因受體材料，其轉化率與原生質體制備的成功率和質量的程度密切相關[10]。目前關于細基江蘺繁枝變種原生質體制備條件優化的研究尚未見報道，本研究擬從酶解液組分、酶解溫度和酶解時間等因素對細基江蘺繁枝變種原生質體的制備條件進行優化，旨在分離獲得產量高、活性好的原生質體，為該品種的遺傳改良提供一個有效的技術途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

細基江蘺繁枝變種：從福建東山島杏陳鎮(23.751 580°N、117.396 210°E)采集。

主要實驗試劑：纖維素酶R-10、離析酶R-10、果膠酶Y-23，均購自日本Yakult公司；瓊脂糖酶(Agarase)、FDA染料，均購自Sigma公司。

1.2 藻種培養

細基江蘺繁枝變種從福建東山島采集回實驗室后，于無菌海水中用軟毛刷清洗藻體[11]，去除藻體表面的沙泥等雜物，用鹽度為25的無菌海水(含200 mg/L卡那霉素)再清洗3次，然后在25℃、120 μmoL photons·m-2·s-1光照培養箱中培養1～2 d。

1.3 方法

1.3.1 藻段選擇與處理

選取新鮮、幼嫩且生長狀態良好的細基江蘺繁枝變種，摘取位于頂端的藻段，將其切成2～3 cm長的藻段并于含1.5%碘化鉀(KI)的無菌海水中浸泡10 min后，用無菌海水沖洗2次，再將藻段切成1～2 mm2小藻塊，用無菌海水沖洗2次，備用。

1.3.2 不同酶解液組分對原生質體得率的影響

1)酶解液配制

酶解液組分E1：鹽度為25的無菌海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、10 U/mL 瓊酯糖酶，pH 6.3，充分溶解后，12 000 r/min、4℃離心 5 min，將上清液轉移到新的50 mL離心管中，置于冰上備用。

酶解液組分E2：鹽度為25的無菌海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、0.5%果膠酶Y-23、10 U/mL 瓊酯糖酶，pH 6.3，充分溶解后，12 000 r/min、4℃離心 5 min，將上清液轉移到新的50 mL離心管中，置于冰上備用。

2)原生質體制備

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入到上述兩種酶解液(10 mL/g)中，分別置于25、28℃恒溫搖床低速搖動(80 r/min)，進行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、8 h的原生質體，具體步驟如下：先用40 μm一次性細胞篩濾去未被酶解的殘留物，往濾出液中加入等體積的提取緩沖液(500 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、5 mmol/L CaCl2、20 mmol/L Hepes、300 mmol/L 甘露糖醇、300 mmol/L 山梨糖醇，調pH值至7.2，121℃滅菌20 min)，靜置10 min，800 r/min離心5 min，棄90%上清液，用1 mL提取緩沖液重懸，800 r/min離心5 min，棄除殘余的酶液，再用500 μL提取緩沖液重懸，取10 μL重懸液于血球計數板中計數，計算每克組織的原生質體得率，確定最佳酶解液組分。

1.3.3 酶解溫度對原生質體得率的影響

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入2 mL酶解液組分E2(提取效果比酶解液組分E1好)，分別置于22、25、28℃恒溫搖床低速搖動(80 r/min)，進行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、8 h的原生質體，具體步驟同方法1.3.2中“原生質體制備”，分別取10 μL重懸液于血球計數板中計數，計算每克組織的原生質體得率，確定最佳的酶解溫度。

1.3.4 酶解時間對原生質體得率的影響

取0.2 g藻塊(1～2 mm2)分別加入2 mL酶解液組分E2，置于28℃(提取效果最佳)恒溫搖床低速搖動(80 r/min)，進行黑暗酶解；分別離心收集酶解4、6、7、8、10 h的原生質體，具體步驟同方法1.3.2中“原生質體制備”，分別取10 μL重懸液于血球計數板中計數，計算每克組織的原生質體得率，確定最佳的酶解時間。

1.3.5 原生質體活性檢測

取100 μL新鮮分離獲得的原生體加入1 μL 二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate，FDA)溶液(5 mg/mL)，室溫黑暗放置10 min，800 r/min離心5 min，棄上清液，用100 μL新鮮的提取緩沖液重懸，于熒光顯微鏡(Axio Lab.A1，ZEISS，德國)中觀察FDA綠色熒光，判斷分離獲得的原生質體活力。

1.4 數據處理

采用GraphPad Prism 5軟件對實驗數據進行整理分析，利用column功能生成各組數據的柱狀圖；運用SPSS軟件分析比較不同處理組間實驗數據的顯著性差異并將分析結果添加到柱狀圖上。

2 結果

2.1 不同酶解液組分對原生質體得率的影響

酶解液組分E1和酶解液組分E2分別于25、28℃條件下的原生質體提取效果如表1和圖1所示。在25、28℃條件下，酶解液組分E1和酶解液組分E2的原生質體得率隨著酶解時間的增加而增加，酶解8 h的原生質體得率最高；28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體得率均高于25℃條件下的得率。江蘺細胞壁富含果膠，在酶解液組分E2中添加0.5%果膠酶Y-23，其在25、28℃條件下酶解8 h的原生質體得率均高于酶解液組分E1，且差異顯著(P<0.05)，因此后續實驗中使用酶解液組分E2進行原生質體的提取。

表1 不同酶解液組分在不同時間和溫度條件下的原生質體得率

注：圖1為酶解液組分E1和酶解液組分E2分別在25、28℃條件下酶解8 h的原生質體得率差異顯著性分析。1.酶解液組分E1在25℃條件下酶解8 h的原生質體得率；2.酶解液組分E2分在25℃條件下酶解8 h的原生質體得率；3.酶解液組分E1在28℃條件下酶解8 h的原生質體得率；4.酶解液組分E2分在28℃條件下酶解8 h的原生質體得率。*表示P<0.05。

2.2 酶解溫度對原生質體得率的影響

分別離心收集22、25、28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體，計算得出原生質體得率，實驗結果如圖2所示。22℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.25±0.21)、(6.84±0.12)、(8.16±0.18)；25℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.45±0.12)、(7.76±0.23)、(9.35± 0.11)；28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.58±0.22)、(8.13±0.12)、(10.67±0.21)。

研究發現，28℃條件下酶解4、6、8 h的原生質體得率均高于22℃和25℃條件下的原生質體得率。當酶解時間為4 h時，22、25、28℃條件下的原生質體得率差異不明顯；隨著酶解時間的增加，原生質體得率升高；當酶解時間為8 h時，28℃條件下的原生質體得率為(10.67±0.21)×105protoplasts/g FW，高于22℃和25℃條件下的原生質體得率。28℃條件下酶解6 h的原生質體得率與22℃條件下酶解8 h的原生質體得率相當。

2.3 酶解時間對原生質體得率的影響

分別離心收集28℃條件下酶解4、6、7、8、10 h的原生質體，計算得出的原生質體得率如圖3所示。酶解4、6、7、8、10 h的原生質體得率(×105protoplasts/g FW)分別為(2.67±0.03)、(8.17±0.11)、(10.67±0.26)、(11±0.22)、(9.17± 0.31)。酶解4～8 h內，隨著酶解時間的增加，原生質體得率逐漸增加，然而酶解時間超過8 h時，由于原生質體的相互擠壓破膜，導致原生質體得率反而減少，故最佳酶解時間為8 h。

2.4 原生質體活性檢測結果

FDA進入活的細胞內會被胞內脂酶分解，生成有極性、能產生綠色熒光的物質——熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜而積累在細胞膜內，而且只有體膜完整、具有活力的原生質體才能在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光。剛分離獲得的原生質體經FDA染色后，在熒光顯微鏡下能夠觀察到較亮的綠色熒光，表明提取的原生質體膜完整、活力較好(圖4)。

注：a為白色光下觀察結果；b為488 nm激發光下觀察結果。

3 討論

3.1 實驗材料對原生質體得率的影響

細基江蘺繁枝變種的生長狀態、細胞壁厚度等因素都會影響原生質體的得率。Yeong H Y等[9]認為江蘺的生長狀態、年齡、生長速度、實驗室培養的時間和生長季節都能影響江蘺原生質體的質量和產量。Huddy S M等[12]認為較嫩的藻段因細胞壁較薄，從中可提取的原生質體質量較好，產量較高。本研究選用位于各分支藻體頂端最嫩的新生藻段并用于原生質提取，獲得的原生質體活力最好，產量最高；在細江蘺生長的季節里，選用3—5月的藻體用于原生質體提取，原生質體的活力和產量均高于其他月份。這可能與江蘺進入春季后開始生長，頂端新生藻段的細胞壁較薄、生長狀態良好有關。

3.2 酶解條件對原生質體得率的影響

Huddy S M等[12]報道Gracilariadura和Gracilariaverrucosa的最佳酶解條件為25℃、酶解4～6 h。Yeong H Y等[9]獲得Gracilariachangii的最佳酶解條件為28℃、酶解3 h。本研究得出的細基江蘺繁枝變種的最佳酶解條件為28℃、酶解7～8 h。由此可見，從不同的江蘺品種中，提取原生質體的最佳酶解溫度和酶解時間不同，這可能與不同江蘺品種的細胞壁的組成成分不同有關。果膠物質是植物細胞壁成分之一，存在于相鄰細胞壁間的胞間層中，起著將細胞粘在一起的作用，酶解液中添加0.5% 果膠酶Y-23可顯著提高細基江蘺繁枝變種原生質體得率。此外，細基江蘺繁枝變種富含瓊脂，用于原生質體制備的瓊脂糖酶的質量也是影響原生質體得率的關鍵因素之一。

4 結論

研究發現細基江蘺繁枝變種原生質體制備的最佳酶解條件為：1)酶解液組分：鹽度為25的滅菌天然海水中加入10 mmol/L CaCl2、0.8 mol/L D-甘露醇、2%纖維素酶R-10、1%離析酶R-10、0.5%果膠酶Y-23、10 U/mL 瓊脂糖酶，pH 6.3；2)酶解條件：28℃、80 r/min、黑暗酶解8 h。本研究將為后續以原生質體作為受體材料的江蘺品種的遺傳改良提供一個有效的技術途徑。