TAP和Hsp90ɑ檢測在肺癌惡性胸腔積液診斷及預后評估的價值

蘇世紅 尹永杰 張玉 徐愛暉

惡性胸腔積液(MPE)是腫瘤細胞播散至胸膜導致淋巴回流受阻引起的。MPE是中晚期肺癌最常見合并癥[1]，中位生存期僅4～12個月[2]。胸水脫落細胞學或胸膜活檢是診斷MPE主要方法[3]，但陽性率較低。因此，腫瘤標志物診斷MPE的功效受到了更多關注。

臨床常用的肺癌三項包括癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白可溶性片段211(CYFRA211)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)，因不穩定性及多樣表達對MPE診斷存在局限性[4-5]。異常糖鏈糖蛋白(TAP)是細胞癌變后基因表達的特異性物質。熱休克蛋白90α(Hsp90ɑ)為可提示腫瘤增殖及侵襲轉移的細胞質蛋白質[6]。目前，關于TAP和Hsp90ɑ對MPE診斷評估的研究甚少。本研究通過TAP和Hsp90ɑ在外周血和胸腔積液中差異表達，評價其在肺癌惡性胸腔積液診斷及預后預測中的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

本研究為前瞻性研究，該研究經我院論理委員會批準(批號：PJ2022-06-35)，所有患者均被告知研究目的及程序，簽署書面知情同意書。收治2019年2月-2020年12月安徽醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科67例胸腔積液和肺部占位患者，隨訪1年至2021年12月，期間中途退出6例，失訪7例，最終入組54例患者。男性39例(72.22%)，女性15例(27.78%)，年齡23～91歲。分為良性胸腔積液組19例，肺癌惡性胸腔積液組18例,Ⅲ期～Ⅳ期肺癌(不伴有胸腔積液)組即中晚期肺癌組17例，在性別、年齡構成比上，各組研究對象差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。納入標準：(1)分組：肺癌惡性胸腔積液組和中晚期肺癌組：依據《惡性胸腔積液診斷與治療專家共識》[7]、《中華醫學會腫瘤學分會肺癌臨床診療指南(2021版)》[8]和《國際肺癌TNM分期標準(第八版)》[9]，經胸腔積液脫落細胞學、經皮肺穿刺活檢和支氣管鏡證實查見癌細胞；進行頭顱MRI、骨ECT或PET-CT等檢查綜合評估；良性胸腔積液組：依據臨床表現、上述病理檢查及治療后效果等綜合為良性胸腔積液(結核性胸膜炎、肺部感染、低蛋白血癥等)；(2)入院前未接受針對性治療；(3)精神狀態良好，臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他臟器惡性腫瘤；(2)存在手術禁忌或麻醉藥物過敏者；(3)依從性差，中途退出或失訪者。

二、試劑與儀器

CEA、CYFRA21-1和NSE檢測由瑞士羅氏公司的酶聯免疫(ELISA法)試劑盒和電化學發光分析儀完成。TAP檢測由瑞生醫療科技有限公司TAP(凝聚法)試劑盒和瑞生TAP醫學顯微圖像分析儀完成。Hsp90ɑ檢測由普羅吉生物科技發展有限公司Hsp90ɑ試劑盒和DIATEK DR-200B系列酶標儀分析儀完成。

三、研究方法

1 標本的收集及處理

(1)外周血：清晨、空腹，采集靜脈血(EDTA抗凝管)2mL，4 ℃, 1500 r/min, 離心15 min，分離血漿用于Hsp90ɑ檢測；另采集3～5mL無添加劑的非抗凝血標本，分離血清，用于TAP、CEA、CYFRA21-1和NSE檢測。

(2)胸腔積液：常規消毒行胸腔穿刺抽液術，抽取100mL胸腔積液，3000r/min，離心5min，棄上清，加入適量細胞清洗液，重復上述操作，取上清液和紅細胞中間的細胞層作涂片，固定、HE染色后顯微鏡下觀察；考慮為可疑腫瘤細胞或腫瘤細胞，進一步做石蠟包埋切片，行免疫組化。

(3)腫瘤組織：電子支氣管鏡或經皮肺穿刺活檢、超聲支氣管鏡(EBUS)刷檢細胞學涂片，HE染色后觀察細胞形態，考慮為可疑癌細胞或癌細胞，行免疫組化。

2 測定方法

(1)肺癌三項：用電化學發光免疫測定法，按羅氏試劑盒操作，電化學發光分析儀檢測含量。

(2)Hsp90ɑ：用ELISA法按PROTGEN試劑盒步驟檢測，酶免疫分析儀進行檢測。

(3)TAP：取30μl全血，滴2滴血液涂血片，靜置晾干，間隔均勻滴加凝聚助劑，自然干燥2小時后將其放置顯微鏡下，找TAP凝聚顆粒測定面積。TAP凝聚顆粒呈淡黃色、棕黃色或淡綠色，周圍呈棕墨綠色或黑色，呈不規則類圓形。單顆凝聚顆粒面積>81 μm2的特異凝集物為有效凝集顆粒。若單顆顆凝聚顆粒面積≥225μm2，則結果為“該顆粒面積”；如果有效凝聚顆粒≥2，為所有顆粒實測面積之和×0.62為特異凝集物的最終數值。

四、判讀標準

CEA正常參考值<5.0 ng/mL。NSE正常參考值<3.3ng/mL。CYFRA21-1正常參考值<16.3ng/mL。Hsp90ɑ正常參考值范圍0～82ng/mL。TAP正常參考值：陰性：無明顯凝聚物(面積0～121μm2)；陽性：凝聚物較小(面積121～225μm2)/較大(面積≥225μm2)。

五、隨訪

電話或門診隨訪，隨訪時間截止于2021年12月31日，期間退出6例(0.09%)，失訪7例(0.1%)。

六、統計學方法

結 果

一、外周血中肺癌三項、TAP和Hsp90a的表達水平。

與良性胸腔積液組比較，肺癌惡性胸腔積液組和中晚期肺癌組外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a的表達水平顯著升高，且肺癌惡性胸腔積液組升高更明顯(見表1)。

表1 三組患者外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90ɑ的表達

二、外周血中肺癌三項、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液患者中的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示，外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a均具有診斷價值(P<0.05)(圖1A)。進一步研究發現TAP和Hsp90a聯合檢測診斷價值更高，不僅高于單項指標的診斷價值，且TAP和Hsp90a聯合檢測AUC值(AUC=0.915)高于肺癌三項的AUC值(AUC=0.904)(P<0.05)(圖1B)。

圖1 A ROC曲線示外周血中肺癌三項、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價值.B ROC曲線示外周血中TAP和Hsp90a聯合檢測與肺癌三項在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價值。

三、外周血中肺癌三項、TAP和Hsp90a在中晚期肺癌患者中的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示，外周血中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a對中晚期肺癌患者均具有診斷價值(P<0.05)(圖2A)；聯合檢測較單項檢測診斷價值更高，TAP和Hsp90a聯合檢測AUC值(AUC=0.892)高于肺癌三項的AUC值(AUC=0.879)，TAP和Hsp90a聯合檢測對于中晚期肺癌患者的診斷價值高于肺癌三項(P<0.05)(圖2B)。

圖2 A ROC曲線示外周血中肺癌三項、TAP和Hsp90a在中晚期肺癌中的診斷價值。B ROC曲線示外周血中TAP和Hsp90a聯合檢測與肺癌三項在中晚期肺癌中的診斷價值。

四、胸腔積液中肺癌三項、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液患者中的診斷價值

ROC曲線分析結果顯示，胸腔積液中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90a對肺癌惡性胸腔積液患者均具有診斷價值(P<0.05)(表2、圖3A)；胸腔積液中TAP和Hsp90a聯合檢測AUC值(AUC=0.974)高于肺癌三項的AUC值(AUC=0.921)，胸腔積液中TAP和Hsp90a聯合檢測對于肺癌惡性胸腔積液患者的診斷價值比肺癌三項更有意義(P<0.05)(圖3B)。

圖3 A ROC曲線示胸腔積液中肺癌三項、TAP和Hsp90a在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價值。B ROC曲線示胸腔積液中TAP和Hsp90a聯合檢測與肺癌三項在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價值。

表2 兩組患者胸腔積液中CEA、CYFRA21-1、NSE、TAP和Hsp90ɑ的比較

五、肺癌惡性胸積液患者生存期分析

單因素COX回歸分析結果顯示(表3)，胸腔積液中的TAP和Hsp90ɑ與肺癌惡性胸腔積液患者生存期相關(P<0.05)，將其分析結果中有統計學意義的指標進行多因素COX風險比例回歸分析(表4)，結果顯示胸腔積液中TAP和Hsp90ɑ均為獨立影響因素和危險因素(P<0.05)，TAP和Hsp90ɑ表達量越高，生存期越短(圖4A、圖4B)。

表3 單因素COX回歸分析

表4 多因素COX回歸分析

圖4 A TAP作為獨立影響因素的生存曲線圖。B Hsp90a作為獨立影響因素的生存曲線圖。

討 論

我國每年約有100萬MPE患者，肺癌占MPE病因的1/3[10]。因MPE診斷陽性率差異大，陽性率偏低，受腫瘤負荷、病理診斷醫師經驗、腫瘤類型等多種因素影響[11]，導致近40%MPE患者無法明確診斷。在過去的幾十年中，肺癌惡性胸腔積液的5年生存率無顯著提升。因此，尋找直接或間接反應惡性病變的腫瘤標志物，探討其診斷價值及評估預后，是現今臨床醫學研究的熱點。

腫瘤標志物在組織里的濃度較高，需要達到一定濃度才可以檢測出，因此對檢測技術的要求、組織取材量以及患者配合度，都有一定的要求，對診斷造成了一定的局限性，因此臨床上多同時采用易獲取的外周血用于協助診斷。TAP位于腫瘤細胞表面和細胞外基質中，糖鏈的分子小，易于定量測量，在疾病狀態下改變較為顯著，可間接反應細胞癌變的發生和發展情況。TAP可將幾十種異常糖鏈糖蛋白高度聚集，極大地放大了腫瘤信號，從而在一定程度上提升了腫瘤檢測靈敏度和準確性，有效地減少漏診率。有研究證實，癌細胞表面異常化糖基、糖鏈的差異表達與其侵襲、發生、發展存在密切關聯[12]。Hsp90α是存在真核細胞中的分子伴侶蛋白，參與細胞活化、凋亡、增殖、侵襲、轉移。有報道稱，肺癌患者癌組織中Hsp90α表達水平與臨床分期、淋巴結轉移呈正相關，惡性胸腔積液中Hsp90α表達明顯升高，提示Hsp90α可能與肺癌惡性胸腔積液有關[13]。這與我們的研究結果一致，我們發現肺癌惡性胸腔積液組患者，無論是外周血還是胸腔積液中TAP和Hsp90α的表達水平，較良性胸腔積液組和中晚期肺癌組均明顯升高，中晚期肺癌組外周血中TAP和Hsp90α表達，較良性胸腔積液組表達增高，差異均具有統計學意義。由此可見，TAP和Hsp90α對肺癌惡性胸腔積液具有潛在的診斷效能。

目前腫瘤標志物種類較多，由于單一指標檢測對惡性腫瘤診斷的靈敏度與特異度均不高，故多采用聯合檢測。目前臨床上廣泛使用的肺癌三項可有效判斷肺癌，但在肺癌惡性胸腔積液的診斷中，既往的研究結果提示其靈敏度和特異度相對較低。TAP和Hsp90α在肺癌惡性胸腔積液的研究甚少，二者聯合檢測目前尚未見相關報道。本研究中ROC曲線分析結果顯示肺癌惡性胸腔積液組患者外周血和胸腔積液中TAP和Hsp90α聯合檢測的AUC值不僅高于良性胸腔積液組和中晚期肺癌組AUC值，還明顯高于各組中肺癌三項的AUC值，提示TAP和Hsp90a聯合檢測對于肺癌惡性胸腔積液的診斷效能更優。進一步分析我們發現，肺癌惡性胸腔積液患者在胸腔積液中聯合檢測TAP和Hsp90α的AUC值高于外周血中的AUC值，說明胸腔積液中TAP和Hsp90α的聯合檢測在肺癌惡性胸腔積液中的診斷價值比外周血中聯合檢測更有意義；若胸腔積液和外周血同時檢測，可能更有助于肺癌惡性胸腔積液的診斷。肺癌惡性胸腔積液患者胸腔積液中TAP和Hsp90α表達水平明顯高于外周血中的表達，考慮與肺癌胸膜轉移導致的惡性胸腔積液中腫瘤標志物的濃度增加有關，也意味著病情進展到終末期，預后可能也較差。為進一步驗證，我們進行了維持1年的隨訪，經COX回歸分析結果顯示，胸腔積液中TAP、Hsp90a的表達水平與肺癌惡性胸腔積液患者預后密切相關，是影響生存期的獨立危險因素。依據研究的預測模型，TAP和Hsp90a可指導疑似肺癌惡性胸腔積液患者進一步行病理檢測確診；并且聯合患者臨床相關資料、TAP和Hsp90a檢測結果等可有效預測患者預后。

綜上所述，TAP和Hsp90α在肺癌惡性胸腔積液患者胸腔積液和外周血中表達量均較高，二者聯合檢測可提升其診斷的特異度和靈敏度，對肺癌惡性胸腔積液的篩查、診斷及其預后，可能具有一定的臨床應用價值。TAP和Hsp90α聯合檢測能否用于肺癌惡性胸腔積液風險評估模式，仍需要更多的臨床數據進一步驗證。