基于CRISPR/Cas9技術構建AMPKα1敲除的3T3-L1細胞系

胡艷波 高 峰 劉尚奇 張慧明 王敏杰

肥胖是一個日益受到全球關注的健康問題，與許多慢性疾病的發展有關[1]。例如心血管疾病、血脂異常、高血糖、炎癥、高血壓、糖尿病等[2]。肥胖主要與脂肪細胞增多和組織內脂質積累有關[3]。脂肪形成是前脂肪細胞分化并向成熟脂肪細胞轉化的結果[4]。而近年來研究表明，激活AMPK會抑制成脂轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ、CCAAT/增強子結合蛋白α和甾醇調節元件結合蛋白1的表達，從而抑制了前脂肪細胞的分化[5，6]。此外，AMPK的激活會使與脂肪酸和膽固醇合成有關的關鍵代謝酶失活，包括乙酰輔酶A羧化酶和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，影響脂質的合成[7]。

AMPK被認為是治療肥胖和相關代謝性疾病的靶點[8]。例如，近年來有很多相關研究，民間藥物馬齒莧中的hm -色酮通過激活AMPK來抑制脂肪細胞分化和脂肪形成[9]；中華狼尾草提取物sinensol-C通過調節脂肪轉錄因子和AMPK活性抑制3T3-L1細胞脂肪生成[10]；竹節參總皂苷通過AMPK減少NF-κB的表達來減輕炎癥[11]；川芎嗪通過AMPK/NF-κB途徑減輕過敏性氣道炎癥和氧化應激等通過以上研究，可以看出AMPK在前脂肪細胞成熟為脂肪細胞的過程中發揮著重要作用[12]。

CRISPR/Cas9是古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，用來對抗入侵的病毒及外源DNA[13,14]。CRISPR/Cas9基因編輯技術的應用獲得了2020年諾貝爾化學獎，這項技術是用于基因編輯中前沿的方法[15]。該技術成果已廣泛地應用于各個物種的基因組精確修飾，展現出其極大的應用潛力。

本研究利用CRISPR/Cas9技術，使被剪切的基因用同源修復和非同源末端連接途徑造成移碼突變，成功構建了AMPKα1基因敲除的3T3-L1細胞系[16]。將3T3-L1細胞誘導成成熟的脂肪細胞，即可研究AMPKα1基因與脂肪細胞的炎癥、米色化、能量代謝等一系列實驗[17～19]。也可以在細胞水平上初步驗證AMPK與高血壓、高血脂、心血管等一系列與肥胖相關的疾病之間的關聯，為后續實驗提供一定的研究基礎。

材料與方法

1.細胞、質粒及菌株：RAW264.7 細胞、3T3-L1細胞、HEK293T細胞、載體質粒與輔助質粒均購自湖南豐暉生物科技有限公司。STBL3感受態細胞購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

2.主要試劑：Esp3Ⅰ酶、T4 DNA 連接酶購自美國Thermo公司，T4多聚核苷酸激酶購自美國NEB公司，無內毒素質粒中提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，慢病毒濃縮試劑盒購自中國愛必夢科技有限公司，陽離子轉染試劑購自北京碼因科技有限公司，DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，氨芐青霉素、硫酸鏈霉素購自上海源葉生物科技有限公司，嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司。

3.質粒構建：設計sg RNA：NCBI查找AMPKα1的基因序列，利用張鋒實驗室網站設計sg RNA，得到兩條sg RNA寡核苷酸序列。將兩條寡核苷酸序列退火克隆到lenti CRISPR載體質粒中。

4.慢病毒包被：構建好的載體質粒與輔助質粒psPAX2、PCMV-VSV-G按照4∶3∶1共同轉染HEK293T細胞中，轉染24h后換液，48h收集第一批慢病毒液，0.22μm濾膜過濾病毒液，4℃保存，備用。

5.構建AMPKα1敲除的3T3-L1細胞系：3T3-L1細胞長到80%～90%時，將4℃保存的慢病毒液與正常完全培養基1∶1加入到3T3-L1細胞中，6h后更換正常培養基。繼續培養72h，加入嘌呤霉素進行篩選，篩選14天。存活的細胞即為構建的AMPKα1敲除的3T3-L1細胞，更換正常培養基培養，傳代，凍存。

6.蛋白質印跡法：使用100mm 培養皿培養細胞，24h后收集細胞，加入500μl細胞裂解液，冰上裂解 30min，離心取上清。BCA蛋白定量后，將蛋白標到同一濃度，取 20μl 蛋白上清液加入4μl 5×蛋白上樣緩沖液，100℃金屬浴5min，進行蛋白 SDS-PAGE 電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉。一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗4次，每次10min，辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫條件下孵育1h，1×TBST洗4次，每次10min，ECL超敏顯色劑顯色。

7.統計學方法：采用Graphpad Prism6.0 軟件進行統計作圖，組間差異進行Oneway-ANOVA參數方差分析，兩組之間采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.lenti CRISPR v2質粒載體簡介：lenti CRISPR v2質粒14873bp，帶有氨芐青霉素抗性，是張鋒團隊改良的病毒的新載體，改良后增加了病毒效價，被廣泛應用于生物科學實驗中(圖1)。克隆sg RNA時多選用BsmBⅠ進行酶切。

圖1 lenti CRISPR v2載體質粒圖譜

2.酶切質粒載體：將5μg的lenti CRISPR v2載體質粒利用酶BsmBⅠ和熱敏感性堿性磷酸酶進行酶切，酶切時加入DTT防止氧化，37℃孵育30min。進行瓊脂糖凝膠電泳(圖2)，可以清晰地看到lenti CRISPR v2載體質粒被切開，將需要的片段利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。

圖2 lenti CRISPR v2載體質粒BsmBⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳

3.退火寡核苷酸：利用張峰實驗室網站設計兩條sgRNA。AMPKα1上游引物：5′-CACCGACGTGGTGGGAAAAATCCGC-3′，下游引物：5′-AAACGCGGATTTTTCCCACCAC-GTC-3′。利用T4多聚核苷酸激酶將兩條sg RNA聚合成雙鏈 DNA，反應條件：37℃，30min；95℃，5min，之后以5℃/min緩慢降溫至 25℃。將得到的產物按照1∶200比例稀釋，4℃或者-20℃保存，用于下一步的克隆。

4.連接質粒載體與sg RNA：將膠回收的載體質粒與稀釋后的sg RNA按照1∶3摩爾比利用快速連接酶進行連接，37℃下孵育10min。

5.轉化：將連接后的體系取出5μl進行轉化，按照感受態細胞的轉化步驟進行轉化后，放在37℃細菌培養箱中培養12～16h，長出為數不多的菌落，挑取單克隆菌落進行一下步驟的質粒擴增。

6.質粒擴增：將單克隆菌落接種到5～10ml的加入了氨芐青霉素的LB液體培養基中，瓶口注意透氣，37℃、220r/min震蕩12h。利用康為世紀無內毒素質粒中提試劑盒提取質粒。

7.瓊脂糖凝膠初步驗證：利用0.75%的瓊脂糖凝膠進行電泳40min，結果如圖3所示，擴增后的片段在13000bp左右，初步判斷是克隆成功的質粒，送北京睿博興科生物技術有限公司測序。

圖3 sg RNA與質粒連接瓊脂糖凝膠驗證

8.測序：測序結果顯示，設計的sg RNA已成功克隆到lenti CRISPR v2載體質粒中。大量擴增后即可進行后續實驗(圖4)。

圖4 sg RNA克隆測序結果

9.3T3-L1殺滅曲線的建立：將3T3-L1細胞制成細胞懸液后，24孔板內以5×104個/孔的密度鋪板，37℃細胞孵育過夜。準備篩選培養基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養基(2、4、6、8和10μg/ml 5個濃度梯度)；往孵育過夜后的細胞內更換新鮮配制的篩選培養基；37℃孵育細胞。更換新鮮的篩選培養基，并觀察細胞存活率。根據細胞的生長狀態，2～3天更換新鮮的篩選培養基；每日監測細胞，觀察存活細胞率，從而確定抗生素篩選開始4天內有效殺死非轉染細胞的藥物最低濃度。殺滅曲線如圖5所示，最終確定嘌呤霉素篩選濃度為4μg/ml。

圖5 3T3-L1細胞嘌呤霉素殺滅曲線

10.構建3T3-L1細胞系：將包被好的病毒液轉染3T3-L1細胞，6h換成正常培養基，72h后用4μg/ml嘌呤霉素進行篩選。篩選14天后，更換正常培養基培養細胞，此時活下來的細胞即為AMPKα1敲除的細胞，將剩余細胞培養長滿培養皿，進行傳代，WB法檢測AMPKα1敲除效率，結果如圖6中A、B所示，Q-PCR檢測AMPKα1敲除效率，結果如圖6C所示。構建的3T3-L1細胞系中，AMPKα1蛋白和mRNA幾乎不表達(P<0.01)，成功構建了AMPKα1敲除的細胞系。

圖6 各組AMPKα1相對表達量

11.脂肪分泌因子對RAW264.7細胞中NF-κB表達的影響：將3T3-L1誘導成成熟的脂肪細胞后，取其培養基與RAW264.7細胞共培養48h后，WB法檢測結果顯示，AMPKα1基因敲除組NF-κB表達增加(P<0.01，圖7)。

圖7 各組NF-κB蛋白相對表達量

討 論

肥胖主要是由卡路里攝入和消耗之間的失控引起，是代謝紊亂的危險因素。肥胖會導致全身性慢性炎性反應，并加劇細胞功能障礙[20]。肥胖患者的C反應蛋白水平顯著升高，其可以通過激活血管周圍脂肪中的炎性反應誘發動脈內皮功能障礙[21]。肥胖還會通過增加氧化應激、脂肪組織內缺氧等導致PVAT釋放脂肪因子功能失調，從而導致PVAT抗收縮作用減弱甚至喪失[22]。

根據《中國心血管健康與疾病報告2020》顯示，心血管疾病的病死率占總病死率的40%以上，而且心血管疾病的病死率一直在上升。其中代謝性心血管病所占比例較高，是指代謝異常與心血管損害之間有較為明確的因果關系，通過干預代謝紊亂可有效改善預后的一種臨床綜合征。雖然目前尚無統一的定義，但在我國心血管患病人數高達3.3億的大背景下，肥胖、糖尿病、血脂異常等已成為代謝性心血管病的重要風險因素。

肥胖與心腦血管疾病關聯緊密，AMPK又是廣泛表達的能量調節關鍵分子。本實驗通過CRISPR/CAS9技術成功構建了AMPKα1敲除的3T3-L1細胞系。為后續研究脂肪組織中AMPK基因與心腦血管疾病提供幫助。還初步驗證了敲除AMPKα1基因后的脂肪細胞分泌的脂肪因子會促進巨噬細胞NF-κB的表達。為后續研究AMPK與炎癥等提供一定的參考價值。

近年來，CRISPR/CAS9技術應用越來越廣泛，為研究者提供了理想的基因敲除手段，本研究詳細地描寫了利用CRISPR/CAS9技術構建基因敲除細胞系的構建方法，從sg RNA的設計到最后的細胞系篩選，為后續構建基因敲除細胞系的研究者提供了可靠的方法，節約其他相關研究人員時間成本。