脂肪間充質干細胞治療復雜性肛瘺的機制探討

秦 菊 江 濱 周春根

復雜性肛瘺是指術后易導致肛門失禁的肛瘺，包括瘺管穿越肛門外括約肌30%以上的肛瘺(高位括約肌間肛瘺、括約肌上肛瘺和括約肌外肛瘺)、女性前側肛瘺以及復發性肛瘺或先前存在大便失禁的肛瘺，炎癥性腸病或放射引起的肛瘺等[1]。手術干預是臨床主要治療方式，治療關鍵在于消除內口及與內口相通的瘺管，最大可能減少對肛門括約肌損傷。但由于內口位置及瘺管走行與括約肌關系復雜，切開掛線等傳統手術創面大、恢復慢，術后患者生活質量下降，肛門功能常易受影響，肛門失禁率發生較高。因此在盡可能減少創傷、保護肛門功能的前提下，提高復雜性肛瘺治愈率既是臨床治療復雜性肛瘺的難點。

脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中分離提取而得到的一種具有自我更新及多向分化潛能的間充質干細胞，具有組織再生與修復、抑制炎性反應及免疫調節等功能。與骨髓、臍帶等其他來源的間充質干細胞比較，ADSCs來源廣泛、取材簡便、可塑性強，免疫原性更低[2]。目前已廣泛應用于退行性疾病、組織修復與重建、免疫系統等相關疾病的預防和治療[3,4]。江濱等[5]將ADSCs用于復雜性肛瘺的治療，其安全性和有效性均得到了證實。然而其作用機制仍不明確，因此，本文對ADSCs治療復雜性肛瘺的機制進行探討，詳見圖1。

圖1 ADSCs治療復雜性肛瘺的可能機制

一、ADSCs生物學特性

1.增殖：ADSCs是一種多能干細胞，具有很強的增殖能力。研究發現，ADSCs在體外培養的2～5天增殖迅速，呈對數式增殖，且增殖速度較其他間充質干細胞更快，經100代增殖擴增后仍能保持正常的二倍體核型，性質仍能保持相對穩定[6]。與骨髓、臍帶等其他來源間充質干細胞比較，ADSCs能更長時間在體外維持其生物學特性。因此，增殖迅速、體外活性持久可能是ADSCs發揮治療作用的前提和基礎。

2.分化：ADSCs具有干細胞所共有的“干性”，能在不同的誘導條件下分化成多種細胞，如脂肪細胞、骨細胞、神經細胞、心肌細胞及成纖維細胞等。目前國內已廣泛將其應用于免疫系統疾病及損傷、燒傷等創傷修復性疾病的治療[7]。目前有研究認為，ADSCs到達肛瘺創面后，在創面組織特定微環境誘導下，通過增殖分化發育為相應組織類型的功能細胞，而促進創面愈合，恢復肛門功能。但ADSCs能否直接分化替代受損細胞卻存在爭議，還需進一步研究探索。相關試驗研究發現，ADSCs移植治療兔肛瘺模型，愈合后的肛門組織充滿了脂肪細胞及新生毛囊腺[8]。

3.分泌：ADSCs具有自分泌、旁分泌和遠程分泌等分泌功能，能在不同的誘導條件下分泌不同的細胞因子[9]。其中，與促進創面愈合相關的因子主要包括：免疫調節因子(如PEG、HGF、IDO)，抗凋亡相關因子(如VEGF、CSF、TGF)，血管生成因子(如VEGF、IGF、bFGF)，細胞生長因子(如IL-6、SCF、LIF、angiopoietin1)及趨化因子(如CCL famliy chemokines、CXCL famliy chemokines)等[10]。

除分泌上述細胞因子外，ADSCs亦能分泌脂肪干細胞外泌體(adipose-derived stem cells exosome，ADSCs-exos)。目前研究發現ADSCs-exos與其來源干細胞有類似的生理功能，更有研究認為干細胞移植的治療作用更多是通過外泌體而發揮作用[11]。相關研究證明，體內和體外培養的ADSCs都能通過主動或被動的方式分泌外泌體，大小為30～150nm，富含與修復再生功能相關的脂類、蛋白質、mRNA、miRNA 及多種生長因子[12, 13]。現有研究認為ADSCs的分泌功能是其發揮治療作用的主要機制之一，而ADSCs-exos可能是其發揮作用的主要介質。

二、ADSCs治療復雜性肛瘺的機制

1.降低炎性反應：過度的創面炎性反應可延緩肛瘺創面的愈合，因此減輕炎性反應是促進復雜性肛瘺創面愈合的重要一環。目前相關研究已證實，ADSCs能顯著降低創面組織中IL-1、IL-6、IL-8、IL -17、IFN-γ和TNF-α等促炎性細胞因子的水平，并能同時增加抗炎性細胞因子IL-3、IL-4、IL-5、IL-10等的表達，通過改變免疫細胞的細胞因子譜，調控免疫細胞的增殖活化從而減輕創面炎性反應，其機制可能與抑制COX-2、PGE2、NF-κB等多種信號通路的活化相關[14,15]。同時，ADSCs通過分泌免疫相關因子，直接作用于免疫細胞而進一步調控免疫炎性反應。如：ADSCs通過分泌PGE2、IDO和s HLA-G5等固有性免疫抑制因子可直接抑制NK細胞的活化；分泌腫瘤壞死因子α刺激基因-6(TSG-6) 可誘導巨噬細胞表型由M1型(促炎型)轉變為M2型(抗炎型)。相關研究發現，M2 型巨噬細胞不僅可分泌IL-10下調炎性反應，同時亦可誘導STAT3 或其他轉錄因子募集而調節血管生成及組織重塑[16]。

此外，ADSCs-exos對降低炎性反應亦具有重要作用。研究發現，ADSCs-exos可誘導巨噬細胞由M1型向M2型的轉化，其具體作用機制可能是通過自身攜帶的miRNA影響巨噬細胞表面的Toll樣受體4的合成而實現的[17]。另有研究發現，ADSCs-exos可通過保護血管屏障的完整性，阻止炎性細胞與內皮細胞結合，從而調節受損內皮細胞的炎性反應[18]。另外，ADSCs-exos亦可通過高表達Nrf2而降低 IL-1β、IL-6 和 TNF-α等炎性細胞因子水平，而降低創面的炎性反應[19]。

2.免疫調節：ADSCs及ADSCs-exos均具有免疫調節作用。ADSCs通過受體-配體相互作用的方式，與T淋巴細胞、B淋巴細胞等特異性免疫細胞及巨噬細胞(Mφs)、NK細胞、和樹突狀細胞(DC)等髓系細胞直接接觸，如阻斷T淋巴細胞周期、抑制B淋巴細胞的增殖和分化、影響DC細胞功能，而進一步影響免疫功能[20]。其主要機制可能與Notch、ERK、MAPK等相關信號轉導通路的活化有關[21,22]。此外，ADSCs通過分泌與免疫調節相關的細胞因子，如IL-10、TGF-β、PGE2和NO等，通過影響免疫細胞活化性受體的表達對免疫細胞進行調控[23]。如：ADSCs分泌TGF-β3和TSP1可促進M2Mφs極化。同時，ADSCs-exos miR-223又能夠靶向pknox1調節Mφs極化，從而共同實現免疫調節[24]。故目前有研究認為，間充質干細胞的免疫調節功能主要是通過產生的可溶性因子及其對免疫細胞的旁分泌作用來實現。

3.促進血管新生：創面局部充足的循環灌注是復雜性肛瘺愈合的必要條件，可促進細胞生長和肉芽組織形成，而充足的循環灌注受微血管數量及微血管功能影響。相關研究認為，ADSCs可直接分化為血管內皮細胞(EC)或通過分泌血管源性生成因子(VEGF、HGF、bFGF、FGF2、TGF-β3)直接誘導EC增殖，促進創面肉芽組織生長和毛細血管網形成，而改善創面血供，促進肛瘺修復[25]；此外，ADSCs通過分泌產生的各類信號因子，如IL、IFN、TNF、CSF、細胞生長因子、趨化因子等調節和改善創面局部微環境，為創面組織和血管的增殖和生長創造適宜微環境[26]。

另外，ADSCs-exos在血管形成過程中具有重要作用。相關研究發現，ADSCs-exos所包含的相關蛋白或RNA可直接調控創面組織細胞基因的表達來誘導EC的增殖，如：ADSCs-exos所攜帶的miR-126、miR-130a和miR-132等miRNA與血管的形成密切相關[13,27]。研究證實，ADSCs-exos攜帶的miR-125a可靶向血管生成抑制因子DLL4的3′非翻譯區，或促進內皮間細胞形成，抑制DLL4表達，促進創面修復過程中的血管生成[28]。Li等[29]研究發現，ADSCs-exos可通過lncRNA H19/miR-152-3p/PTEN軸作用，使成纖維細胞中高表達miR-152-3p，低表達lncRNA H19和PTEN，并同時激活磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸三激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt1)信號通路，減少細胞凋亡，促進創面修復。Wang等[30]研究發現ADSCs-exos可增加成纖維細胞基質金屬蛋白酶-3(MMP3)的表達，調控Ⅰ/Ⅲ型膠原和彈性蛋白的形成比例，促進創面愈合，同時并可抑制創面瘢痕形成，其作用機制可能與 ERK/MAPK 通路的活化相關。促進復雜性肛瘺創面愈合的同時減少瘢痕組織的形成，是ADSCs治療復雜性肛瘺的一大亮點和優勢，而其具體作用機制仍待進一步研究明確。

三、展 望

近年來，ADSCs的安全性和有效性在臨床上均已被肯定，其具有干細胞強大的自我增殖更新、多向分化潛能及分泌功能，且來源廣泛、儲量豐富、易獲得，具有廣闊的臨床應用前景。目前研究認為ADSCs治療復雜性肛瘺可能是基于ADSCs的增殖、分化及分泌功能，從而進一步發揮抗炎、免疫調節和促進血管新生等相關作用，最終實現肛瘺創面的愈合。目前，ADSCs的免疫調節作用是研究的熱點，被認為是其發揮治療作用的主要機制之一，同時ADSCs的分泌功能被認為是發揮治療作用的主要功能基礎，而干細胞治療復雜性肛瘺尚處于研究發展階段，ADSCs治療復雜性肛瘺的具體作用機制及成分尚不明確，有待于進一步研究和探索。