復方卡森糖漿緩解D-氨基半乳糖引起的小鼠急性化學性肝損傷

麥麗開·阿不力米提, 艾山·艾比布勒, 史 深, 阿不都沙拉木·阿不都熱依木, 艾尼瓦爾·塔力甫

(1. 新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心, 烏魯木齊 830002; 2. 新疆維吾爾自治區中醫醫院老年病科, 烏魯木齊 830000; 3. 新疆維吾爾自治區維吾爾醫院,烏魯木齊 830000)

維吾爾醫藥是中國傳統醫藥的重要組成部分，也是我國四大民族醫藥之一［1］，在臨床上廣泛用于炎癥疾病的治療［2］。研究表明，維吾爾醫學常用藥材之一的毛菊苣提取物對小鼠肝纖維化具有一定的保護作用［3］。在維吾爾語中毛菊苣又名卡森新疆地區維吾爾醫學應用中主要取卡森地上部分和根入藥，味微苦、咸，性涼，清肝利膽，用于治療濕熱黃疸、胃痛食少及水腫尿少［4-6］。

復方卡森糖漿由茴香根皮、菊苣根、玫瑰花、黃瓜子、小茴香、菊苣子、葫蘆子仁7 味藥材組成，具有通滯利肝、利尿消腫等功能，用于膽液質過盛而引起的各種疾病。目前，臨床上該藥主要用于肝炎、肝硬化、膽囊炎、帶狀皰疹、蕁麻疹、關節炎等疾病的治療［7］。雖然相關臨床資料已經表明“復方卡森糖漿”具有治療肝病的效果［8-9］，但進一步研究該制劑的保肝作用機制可為復方卡森糖漿的臨床應用提供更多理論基礎，并為新藥開發奠定基礎。

本研究以復方卡森糖漿的保肝作用為切入點，建立D-氨基半乳糖致小鼠急性化學性肝損傷模型，探討復方卡森糖漿對小鼠血清生化肝功能指標及免疫學水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質量為18～22 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（滬）2017-0005］提供，動物質量合格證編號為20170005007808，飼養于新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心實驗動物屏障設施［SYXK（新）2016-0001］。動物在實驗前一周進行適應性喂養，相對濕度為40%～60%，溫度為20～24 ℃，12 h 光照交替，自由飲用凈化水，攝食小鼠標準顆粒飼料（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司提供的SPF級大鼠小鼠維持飼料）。本研究中動物實驗方案經新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心實驗動物福利與倫理委員會審查批準（2020-002），所有動物實驗操作符合實驗動物3R原則及國內外相關的實驗動物福利倫理標準要求。

1.2 主要藥品與試劑

復方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿參考標準物均由新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院制藥廠生產，批準文號分別為新藥文號M20041581、國藥準字Z65020183，規格均為200 mL/瓶。D-氨基半乳糖購自美國Sigma 公司。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）檢測用ELISA 試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測用ELISA 試劑盒均購自武漢酶免生物科技有限公司。血清谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。HE染色液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 主要儀器

AccuteTBA-40FR東芝全自動生化分析儀為日本東芝公司產品；BS323S 電子天平為德國Sartorius 公司產品；SCIENTZ-48高通量組織研磨器購自寧波新芝生物科技股份有限公司；721型分光光度計購自上海第三分析儀器廠。

1.4 動物分組、模型建立及藥物處理

按小鼠體質量隨機分組，分別為正常對照組、模型對照組、炎消迪娜兒糖漿陽性對照組及復方卡森糖漿低、中、高劑量組，共6組，每組8只。復方卡森糖漿低、中、高劑量組分別按原藥液的50%、100%、200%（即用恒溫水浴鍋加熱原藥液使之蒸發水分50%，藥物濃度增加至原來的一倍）配制藥物，按8 mL·kg-1·d-1灌胃，連續7 d［5］。為了證明復方卡森糖漿（新藥）的有效性，將炎消迪娜兒糖漿（國藥）作為陽性對照標準品。陽性對照組按12 mL·kg-1·d-1給予炎消迪娜兒糖漿灌胃，連續7 d。正常對照組和模型對照組給予同體積的生理鹽水。

末次給藥1 h后，除正常對照組外，其他各組小鼠均腹腔注射給予D-氨基半乳糖800 mg/kg，建立急性化學性肝損傷模型。然后觀察各組小鼠的肝損傷病理變化及血清生化水平。

1.5 用藥后小鼠血清生化及免疫學指標測定

肝損傷模型建立24 h 后，腹腔注射戊巴比妥鈉（150 mg/kg）麻醉小鼠。眼球取血［10-11］，常規分離血清并使用試劑盒測定ALT、AST、ALP活性，以此反映肝功能。另外取肝臟組織塊（0.1～0.2 g），放入勻漿管中，冰水浴條件下用機械式勻漿機8 000～10 000 r/min勻漿，10 s/次，間隙30 s，連續3～5次。將制備好的10%勻漿液用普通離心機（2 500 r/min）離心10～15 min，取上清液，采用ELISA法測定SOD、GSH-Px、MDA含量，以反映肝細胞損傷程度。

1.6 用藥后小鼠肝臟組織病理學觀察

動物分組前、解剖前各測量一次體質量，解剖后測量肝臟和脾臟質量，并計算肝脾指數（小鼠肝臟或脾臟質量/小鼠體質量×100%）。解剖后各組小鼠的肝臟組織經質量分數為4%的中性甲醛溶液固定，常規制片。HE染色法觀察各組小鼠肝組織病理學變化。

1.7 統計分析

采用SPSS 22軟件對各實驗結果數據進行分析。所有數據用±s表示。多組樣本均數比較，首先采用單因素方差分析，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肝脾指數測定

與正常對照組相比，模型組小鼠的肝臟指數及脾臟指數均有升高，其中肝臟指數升高具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，復方卡森糖漿低、中劑量組小鼠的脾臟指數（0.26±0.05）、炎消迪娜兒糖漿陽性對照組小鼠的肝臟指數（4.42±0.75）均顯著下降（P＜0.05），詳見表1。

表1 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指數的影響Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

表1 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致小鼠肝、脾指數的影響Table 1 Effect of compound Casson syrup（CCS）on liver and spleen indexes of mice induced by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復方卡森糖漿的陽性對照藥物。與對照組比較，★P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）. Compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

組別Group正常對照Normal control模型對照Model control炎消迪娜兒糖漿對照YS control低劑量復方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16實驗前體質量Pre-test body mass/g 24.00±1.07 25.00±2.39 20.13±3.31 27.50±0.76 22.88±3.36 26.13±0.99解剖前體質量Preanatomic body mass/g 29.19±1.70 28.85±4.88 27.16±2.98 30.99±1.36 28.91±1.75 28.66±1.81肝臟指數Liver index/(mg·g-1)4.95±0.61 5.93±0.84★4.42±0.75#4.50±0.38 5.35±0.83 4.64±0.29脾臟指數Spleen index/(mg·g-1)0.30±0.07 0.36±0.01 0.32±0.05 0.26±0.05#0.28±0.06#0.32±0.06

2.2 肝功能評估

與正常對照組比較，模型組小鼠的血清ALT、AST 和ALP 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，復方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿各給藥組小鼠的血清AST、ALT 水平均有所下降；而各給藥組之間雖有波動，但無顯著性差異。與模型組比較，各給藥組的血清ALP水平顯著下降（P＜0.05），詳見表2。結果提示D-氨基半乳糖可致小鼠肝功能下降，而復方卡森糖漿對肝功能具有一定的保護作用。

表2 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致化學性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

表2 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致化學性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP的影響Table 2 Effects of compound Casson syrup on serum ALT,AST and ALP of mice with chemical liver injury caused by Dgalactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復方卡森糖漿的陽性對照藥物。ALT為谷丙轉氨酶，AST為谷草轉氨酶，ALP為堿性磷酸酶。與對照組比較，★P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.ALT is alanine aminotransferase；AST is aspartate aminotransferase；ALP is alkaline phosphatase.compared with control group，★P＜0.05；compared with model group，#P＜0.05.

組別Group正常對照Normal control模型對照Model control炎消迪娜兒糖漿對照YS control低劑量復方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 ALT z/(U·L-1)34.63±1.41 101.13±51.3★53.60±10.43 59.63±37.74 45.25±17.80 38.80±4.76 AST z/(U·L-1)144.50±27.30 241.25±41.04★216.20±50.45 182.63±56.29 159.13±31.84 145.80±13.03 AST/ALT 4.18±0.84#2.39±1.69 4.19±1.47 3.44±0.99 3.79±0.95 3.83±0.75 ALP z/(U·L-1)171.50±20.10#217.50±81.39★157.80±17.30#169.13±28.98#173.38±27.64#149.60±24.81#

2.3 抗氧化狀態評估

與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟組織勻漿中MDA 和GSH-Px 含量增高（P＜0.05），SOD 含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，復方卡森糖漿各劑量組小鼠肝臟SOD 含量增高（P＜0.05），其中高劑量組增高明顯（P＜0.01）；而MDA 和GSH-Px 含量出現不同程度的降低，有些劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表3。結果提示復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖導致的肝細胞損傷具有一定的拮抗作用。

表3 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致化學性肝損傷小鼠肝組織MDA、GSH、SOD的影響Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

表3 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致化學性肝損傷小鼠肝組織MDA、GSH、SOD的影響Table 3 Effects of compound Casson syrup on MDA,GSH,SOD in liver tissues of mice with chemical liver injury caused by D-galactose（±s,n=8）

注：炎消迪娜兒糖漿用作復方卡森糖漿的陽性對照藥物。MDA為丙二醛，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶；與對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Yanxiaodinar syrup（YS）was used as the positive control of compound Casson syrup（CCS）.MDA is malondialdehyde；SOD is superoxide dismutase；GSH-Px is glutathione peroxidase；compared with the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01；compared with model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別Group正常對照組Normal control模型對照Model control炎消迪娜兒糖漿對照YS control低劑量復方卡森糖漿Low-dose of CCS中劑量復方卡森糖漿Medium-dose of CCS高劑量復方卡森糖漿High-dose of CCS劑量Dose/(mL·kg-1·d-1)- - 1 2 4 8 16 MDA ρ/(μmoL·mg-1)0.79±0.10 0.82±0.14★0.74±0.09#0.56±0.18#0.67±0.12#1.09±0.09 GSH-Px ρ/(nmoL·mg-1)25.60±7.79 32.13±9.24★27.27±9.03 30.34±6.51 26.33±10.05 19.82±16.44#SOD z/(U·mg-1)12.23±3.21b 4.37±3.94★★5.78±1.56#7.30±1.53#5.89±1.64#20.16±5.17##

2.4 組織病理學評估

對照組小鼠的肝小葉結構清晰完整，肝細胞無異常（圖1A）。模型組小鼠的肝索結構紊亂，有明顯的肝細胞灶性壞死，周圍有炎性細胞浸潤，表明存在急性肝組織損傷（圖1B）。陽性組小鼠的局部肝細胞輕度腫大，肝小葉結構無明顯異常，提示肝組織損傷得到明顯改善（圖1C）。與模型組比較，復方卡森糖漿低、中、高劑量組小鼠的肝組織病理損傷得到明顯改善（圖1D、E、F），表現為肝小葉結構較完整，無明顯炎性細胞浸潤。

圖1 復方卡森糖漿對D-氨基半乳糖所致化學性肝損傷小鼠肝組織病理學影響（HE染色，×200）Figure 1 Effect of compound Casson syrup on liver tissue caseology of D-galactose induced chemical liver injury mice（HE staining，×200）

3 討論

近年來，由于不良生活習慣和現代社會生活和工作環境，如高壓力、久坐、熬夜加班、長期酗酒、攝入高熱量食品及慢性病藥物的長期使用等因素，藥物性肝病、酒精性肝病的發病率明顯上升。據統計，2015年我國酒精性脂肪性肝病患者約2 463.5萬人，其中40多歲年齡段的人群的酒精性肝病發病率最高，為10%以上［12］；另外，約有25%的人存在非酒精性肝脂肪［13］?；瘜W性有害物質通過胃腸道和血液循環進入肝臟進行代謝，因此肝臟容易受到這些毒性物質的損害，造成化學性肝損傷。肝損傷動物模型類似于人類肝炎發生的病理生理過程，是篩選保肝藥物較為理想的研究模型之一。因此，應加強實驗與臨床應用的結合，注重整體觀念與辨證論治，從而充分體現傳統醫藥治療化學性肝損傷的優勢及廣闊前景［14］。

本研究通過D-氨基半乳糖誘導建立了ICR 小鼠急性化學性肝損傷模型，模型組小鼠的肝、脾臟指數均顯著升高，說明肝臟和脾臟均受到化學物質的影響。其中，炎消迪娜兒糖漿陽性對照組小鼠的脾臟指數偏低應不是毒性反應，而是與當時動物體質量偏小相關。肝功能指標檢測數據表明，復方卡森糖漿各劑量組具有保肝作用。本研究表明，復方卡森糖漿給藥組小鼠血清中ALT 和AST 水平均明顯低于肝損傷模型組，說明中藥在降低ALT、AST 以及保護肝細胞方面起到了一定的作用；該結果與以往文獻結論［15-16］相一致。進一步評估各組小鼠的抗氧化狀態，結果顯示模型組小鼠肝組織勻漿中MDA、GSH-Px 值升高，SOD 含量明顯降低，并且HE染色后觀察發現模型組小鼠的肝組織發生了病理學改變，說明化學性肝損傷模型建立成功。

復方卡森糖漿對肝損傷的修復作用，是因為復方卡森糖漿通過影響肝臟代謝機能，增強抗氧化作用，調節機體免疫，保護受損肝細胞。復方卡森糖漿和炎消迪娜兒糖漿都是臨床上用于炎癥疾病治療的主要中藥制劑。本研究中同時使用炎消迪娜兒糖漿作為陽性對照，可以證明動物實驗具有檢驗靈敏性，即能夠證明陽性藥物的有效性。

本實驗結果表明，復方卡森糖漿可以有效緩解D-氨基半乳糖引起的小鼠急性化學性肝損傷。本實驗以復方卡森糖漿的保肝作用為切入點，研究該制劑的保肝作用可為復方卡森糖漿的臨床應用提供理論基礎，并為新藥開發奠定基礎。

[醫學倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究涉及的所有動物實驗均已通過新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心實驗動物福利與倫理委員會實驗動物倫理委員會審查批準（No.2020-002）。所有實驗過程均遵照實驗動物相關法律法規條例要求進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Experimental Animal Welfare and Ethics Committee of Xinjiang Center for Disease Control and Prevention(Approval Letter No.2020-002),and all experi-mental protocols were carried out following the guidelines such asAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal: Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018), ARRIVE 2.0, IGP 2012 and IAVE 2010.

[作者貢獻]Author Contribution]

麥麗開·阿不力米提負責文獻查閱和整理，以及文章撰寫與修改；艾山·艾比布勒和史深協助完成動物實驗，并整理分析數據；阿不都沙拉木·阿不都熱依木參與文章思路及整體內容的討論；艾尼瓦爾·塔力甫負責實驗設計與審核，并對全文內容進行指導。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。