潰瘍性結腸炎動物模型研究進展

胡 宇, 蘭昀羲, 陳曉曉, 熊 偉, 唐宋琪, 賈 波, 黃 巍

(1. 成都中醫藥大學,成都 611137; 2. 成都岐黃博恩生物科技有限公司,成都 611139; 3. 海南醫學院,海口 571199)

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明，波及結腸與直腸的慢性、特發性炎性腸病［1］。據世界胃腸病學組織描述，UC 在30～70 歲人群中發病率基本穩定，性別間發病率也基本持平。但從整體人群而言，該病在世界范圍內發病率正在不斷上升，在我國等新興工業化國家和地區這一表現更為顯著［2］。雖有大量研究證明UC 是由遺傳、飲食等危險因素誘發的宿主異常免疫反應導致的一種炎性腸病，但目前對于其發病機制仍然缺乏全面的認識。因此，仍需要更多的動物實驗研究來深入探討UC 發生發展機制。

迄今為止，UC 動物模型造模方法較多、機制各異［3］，并且缺乏標準統一的評價指標。雖然已有文獻對UC動物模型進行了一定的綜述，但多集中在對不同動物模型的介紹及原理闡述方面，往往忽略了具體造模方法的整合與對比，對于研究者選擇動物模型時的參考意義有限。同時，評價指標的選取是檢驗動物模型有效性的必要依據，對于評價指標體系的總結尚未完善。因此，本文通過對現有UC模型動物的選擇、動物模型的建立方法以及評價指標的選取進行文獻綜述，以期為UC動物實驗中模型選取提供較為全面的參考依據，同時為動物模型和評價指標的優化提供理論基礎。

1 造模方法及模型動物的選取

UC的主要特征表現為結腸及直腸長期反復發作的慢性炎性反應，其發病機制與機體免疫系統的紊亂和異常的免疫反應密切相關［4］。因此，通過藥物對動物腸道產生一定的化學刺激或直接損傷，模擬腸道局部的炎性反應損傷，是目前UC動物模型最常用的造模方法［5］。除此以外，通過異體抗原誘發動物腸道的異常免疫反應，也是較為常用的造模方法。而得益于基因組學的進步和技術發展，基因工程技術誘導動物出現自發性結腸炎也成為現今動物模型發展的重要趨勢。

1.1 化學藥物、異體抗原或二者聯合使用

化學藥物誘導是最經典且最為常用的UC動物模型建立方法。可用于誘導動物UC 的化學藥物種類較多［6］。葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）、噁唑酮（oxazolone，OXA）以及乙酸是最為常用的化學誘導藥物，而2，4-二硝基氯苯、甲醛等藥物同樣也在不同研究中被選用。由于自身的化學特性，不同藥物對于動物UC 的誘導機制、病理改變、恢復情況不盡相同。

DSS 誘導的動物模型具有造模方法簡單的特點，只需將一定濃度的DSS 溶液予以動物自由飲用便可成功誘發動物結腸炎性反應，且研究者可根據實驗需求選擇合適的藥物濃度及給藥時間。DSS 可破壞動物結腸上皮細胞，損害上皮屏障功能，使腸腔中炎性物質入侵固有層及黏膜下層，以誘發動物異常的免疫反應［7］。但DSS 所誘導的動物結腸炎性反應多為急性表現，炎性反應在停藥8～9 d后便可恢復［8］，這可能對開展常規研究造成一定的局限性。而在DSS 長期給藥后，動物又可能出現結腸上皮萎縮，增加癌癥的發生率，因此其慢性給藥誘發的動物模型更適用于UC相關性結直腸癌的評價和研究。

TNBS作為一種半抗原，在給藥時往往需要同一定濃度的乙醇溶液相混合，再通過灌腸給藥。乙醇可直接對動物黏膜屏障造成破壞，而TNBS通過與大分子物質結合形成全抗原誘導免疫反應，導致促炎細胞因子釋放，誘發局部炎性反應［9］。在TNBS和乙醇的共同作用下，動物結腸炎性反應由急性炎性反應向慢性炎性反應轉變，更接近于人類UC的臨床表現［10］。但TNBS所誘導的動物免疫反應以Th1/Th17 反應為主，被認為更接近于克羅恩病［11］。因此，TNBS 所誘導的動物模型是否能夠代表人類UC的發病機制仍然存在爭議。

OXA 與TNBS 同為半抗原藥物，同樣需與乙醇聯用。但與TNBS不同，OXA可誘發動物Th2細胞介導的免疫反應，這與人類UC 發病機制更加接近［12］。但在造模時動物的高死亡率［13］及病變明顯的自限性導致其并未成為最廣泛使用的造模藥物。

乙酸所誘導的動物模型雖然具有操作簡單、成本低廉等優勢，但其誘發的動物結腸炎性反應與單純性結腸急性炎性反應更相似［14］，因此乙酸在對人類UC發病機制、潛力藥物機制評估等方面研究并不具備優勢。

化學藥物誘導的UC 動物模型經過較長時間的發展，造模方法已相對成熟，且具有方法簡單、操作簡便、重復性強和價格低廉的特點，因此也成為目前最廣泛使用的UC動物模型。但同時，也有學者認為單純使用化學藥物誘導的動物結腸炎性反應多為急性發作，不符合人類UC病程長、慢性發作的特點，不適合應用于慢性疾病的研究［15］。異體抗原多采用其他動物的結腸組織以對造模動物致敏而誘發其免疫功能紊亂，在此基礎上通過化學藥物刺激腸道局部進一步導致動物異常炎性反應，該方法既可模擬人類UC免疫紊亂的特點，又可體現急性結腸炎的病理改變，被認為更具有人類UC 的代表性［8］。因此，化學藥物與異體抗原聯合誘導的動物模型得以發展。但由于該方法需對模型動物進行前期致敏，造模方法較復雜，實驗周期較長，且后期實驗過程中動物死亡率較高［14］，不可避免對實驗的正常開展造成一定影響。

在具體的實驗動物選擇方面，大鼠及小鼠是較為常用的UC 造模動物。大鼠的常用品種SD 大鼠與Wistar 大鼠，在不同化學藥物或異體抗原等誘導下皆可出現結腸炎癥，且結腸黏膜肌層、杯狀細胞丟失，隱窩形態不規則、排列紊亂以及潰瘍面深達肌層等病理改變也與人類UC 較為接近［15］，因此是較為常用的實驗動物。常見的大鼠UC動物模型造模方法［7-9，15-29］見表1。

表1 常見的大鼠潰瘍性結腸炎模型造模方法及評價指標Table 1 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in rats

同實驗大鼠一致，不同品種品系的小鼠亦可在化學藥物的誘導下出現實驗性結腸炎。但是不同品系小鼠對化學藥物的易感性存在爭議。有學者發現在相同濃度的DSS 自由飲用5 d 后，C57BL/6 小鼠表現出實驗性腸炎的病理改變，BALB/c小鼠的病理改變則已恢復，這提示不同品系小鼠對DSS 的易感性可能不同［30］。此外，與大鼠相比，小鼠生命力較為脆弱，故在面對使用TNBS造模時所需的長期侵入式操作，小鼠耐受力較大鼠更弱，死亡率也更高。因此，在使用化學藥物或異體抗原進行UC動物模型誘發時，大鼠是更為常用和推薦的實驗動物。但迅速發展的基因工程技術與較完善的小鼠全基因組測序數據使得基因敲除所誘發的小鼠UC越發成為研究者首要選擇的模型。常見的小鼠UC模型造模方法［31-44］見表2。

表2 常見的小鼠潰瘍性結腸炎模型造模方法及評價指標Table 2 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in mice

除了大鼠、小鼠外，也有學者使用獼猴［45］、實驗兔［46-47］，甚至斑馬魚［48］來誘發實驗性結腸炎（表3）。但受實驗成本控制、造模技術成熟度等因素影響，上述實驗動物僅被少數研究者用于UC 的造模，其是否能夠成為具有研究意義的動物模型仍需進一步探索。

表3 其他動物潰瘍性結腸炎造模方法與評價指標Table 3 The modeling methods and evaluation indicators of ulcerative colitis models in the other animals

1.2 基因敲除

隨著基因工程技術的深入研究與發展，基因敲除或轉基因誘導已成為一類重要的UC 動物模型建立方法。黏蛋白2（mucin 2，Muc2）由杯狀細胞分泌，是產生黏液、構成上皮屏障的重要蛋白。通過將Muc2基因敲除，導致上皮屏障缺陷，可成功誘發小鼠自發性結腸炎［49-50］。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是經典的促炎細胞因子，其缺失可能導致小鼠白細胞介素（interleukin，IL）-1β 大量增加，再加之Muc2缺失誘發小鼠上皮屏障受損，可以自發誘導實驗性結腸炎［30］。IL-10 本身是一個重要的抗炎細胞因子，而小鼠IL-10基因缺失可以引起IL-10抗炎作用喪失，進一步導致結腸單核吞噬細胞介導的免疫反應，由此引發結腸炎［51］。此外，IL-10 除了作為抗炎細胞因子，還可抑制內質網應激，促進腸道黏液產生。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1）可調控結腸杯狀細胞及吸收細胞間平衡，且Nox1表達水平與腸道黏液厚度呈正相關。對小鼠IL-10 和Nox1 基因雙敲除則可使小鼠出現與人類UC相類似的炎性反應和組織學表現［52］。小鼠多藥耐藥基因1a （multidrug resistance gene 1a，MDR1a） 表 達 與UC 密 切 相 關。MDR1a缺失會導致上皮屏障缺陷，進一步引起腸道微生物群相關產物積累，從而誘發T 細胞亢進并識別抗原，產生免疫反應［53］。

上述研究往往以被證實與UC 發病密切相關的蛋白、因子或相關通路介質為靶點，將實驗動物目標基因進行敲除，以誘導動物自發出現結腸炎性反應，因此基因敲除的動物模型適用于對關鍵基因導致發病機制的研究［54］。但也正因如此，基因敲除所誘導的UC動物模型無法對疾病完整發病機制進行模擬，同時其操作方法復雜，實驗費用昂貴，具有明顯的局限性。

2 UC動物模型評價指標

評價指標不僅對動物模型的造模效應評估十分關鍵，也是研究者實驗過程中必要的數據支撐。評價UC動物模型是否建立成功，目前尚缺乏標準，研究者多采用疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分、組織病理學改變及組織病理學評分，以及結腸組織肉眼評分等指標進行判斷。DAI 評分以實驗動物的體質量、大便性狀改變及隱血作為指標，在造模前后不同時間段進行評估，最終通過評分改變以判斷造模是否成功，這是在UC 動物模型建立中最常用的評價指標［9］。具體的評分方法［42，55］見表4。

表4 潰瘍性結腸炎動物模型的疾病活動指數評分方法Table 4 The disease activity index (DAI) scoring method for animal models of ulcerative colitis

組織病理學改變及評分是將動物結腸組織經HE染色后，光學顯微鏡下觀察結腸結構破壞、炎性細胞浸潤等情況并進行綜合評分，從而評估造模效果。這也是評價模型是否建立成功較常用的一項指標。具體評分方法［56］見表5。

表5 潰瘍性結腸炎動物模型的組織病理學評分方法Table 5 The histopathological scoring method for animal models of ulcerative colitis

此外，結腸組織肉眼評分、結腸組織大體形態損傷評分［57］則是通過對實驗動物結腸組織肉眼觀察，以結腸粘連、局部水腫、潰瘍形成及病變范圍等為標準進行評估。

DAI 評分、組織病理學評分等評分方法作為評價指標被眾多相關研究廣泛使用，且國內外專家和學者仍在不斷對具體評分細則進行完善及更新，但這也意味著目前對于評分的標準尚未得到統一。而結腸組織肉眼評分、結腸組織大體形態損傷評分則僅在肉眼觀察的基礎上對組織損傷程度進行評價，較組織病理學評分而言可參考度較低，因此并未成為目前主流的模型評價指標。此外，上述評分均基于實驗者參照一定依據對實驗動物的癥狀改變及病理表現進行主觀評分，缺乏一定的客觀性。值得注意的是，由于異常炎性反應在UC發病機制中的關鍵作用已被證實，關鍵炎性反應信號通路介導的炎性細胞、促炎細胞因子也開始成為UC 動物模型造模評價的關鍵指標［58］。如李霞等［26］、Catinean 等［20］將大鼠血清IL-6 水平及結腸黏膜中TNF-α表達作為指標進行檢測，以評價造模是否成功。此外，IL-4、IL-8、IFN-γ 等被認為是與人類UC發生相關的細胞因子，也被不同的研究納入作為評價指標［42-44］。但由于目前UC 的完整發病機制仍未揭示，上述炎性細胞因子是否真正是UC發生的關鍵，同樣需要進一步證明。

由于基因敲除動物模型具有較為穩定的遺傳學特征，對基因敲除或其他基因工程編輯動物模型的靶基因進行總結，有利于UC 動物模型評價指標的規范化。例如，IL-10 作為重要的抗炎細胞因子，在UC 發生期間表達降低，且缺失IL-10 可誘發小鼠出現自發性結腸炎，說明其可以作為評價UC 動物模型的潛在指標［51，59］。此外，黏液屏障是保護機體結腸免受腸道內共生微生物及潛在病原微生物定植入侵的重要防線，而分泌黏液的Muc2 蛋白缺失也是UC 患者腸道屏障失調的典型特征，因此Muc2 同樣可能作為評估UC 動物模型的另一潛在指標［49-50，60］。總之，形成標準的評價指標體系，有利于UC動物實驗研究的規范，而基于基因工程的UC動物模型對推進評價指標體系的發展具有明顯優勢。

3 結論

本文對UC 動物模型進行了文獻分析，發現目前UC動物模型的建立方法較多且各有優劣。研究者在進行動物實驗時需根據自身的實驗目的、實驗成本、實驗周期、預期結果等因素進行考量，以選擇相應的動物模型。同時，當下UC 動物模型仍然存在許多不足，仍然缺乏與人類UC具有高度模擬性的動物模型，而且動物模型評價系統也尚未完善。操作性強、造模成本低、模擬程度高且評價系統完善的動物模型可能成為揭示UC發病機制、探索高效治療策略的關鍵工具。因此，在UC的進一步研究中，理想動物模型的探索仍需不斷深入。

[作者貢獻Author Contribution]

胡宇負責選題、論文檢索、論文撰寫；蘭昀羲負責論文檢索與整理；陳曉曉、熊偉負責閱讀整理論文、表格匯總；唐宋琪、賈波、黃巍負責論文審閱、修改。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。