低磁場冷凍對鰱魚肌原纖維蛋白的作用

逯曉燕，劉 麗，黃文哲，叢?；?*，李 昊

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034；3.西北農林科技大學機械與電子工程學院，陜西 楊凌 712100；4.英都斯特（無錫）感應科技有限公司，江蘇 無錫 214000；5.長春皓月集團，吉林 長春 130062）

鰱魚（）是一種廣泛養殖的淡水魚，2021年產量達到381.29 萬t，是新興的魚糜加工原料。鰱魚肌原纖維蛋白（myofibrillary protein，MP）是魚肉中最重要的蛋白質，約占總蛋白含量的50%～55%，在加工貯藏過程中，延緩MP變性很重要。冷凍和冷藏是長期保存魚糜的重要方法，因為低溫會抑制微生物生長，減緩酶的活性，并保留原始風味和營養成分。而在實際的冷凍過程中形成的冰晶會刺穿細胞，導致品質劣化，如持水力下降、汁液損失嚴重和蛋白變性等，這會對最終產品質量產生負面影響，所以亟需新的冷凍方案來優化。

低磁場冷凍是近年來新興的冷凍方式，已經逐漸應用于果蔬、畜產品、微生物和醫學材料的冷凍，其作用方式是將小的水分子團或單個分子轉變為微冰晶形態，并加速通過冷凍相變階段，保護細胞免受冰晶損傷。磁場冷凍最初被用于保存生物細胞和器官等醫療用途，例如：0.01 mT磁場、15 min保持時間和-30 ℃冷凍溫度下，全牙細胞冷凍保存1 年后并未發現細胞損傷；Lin Chunyen等的研究小組在施加0.8 T的靜磁場下，先在-5 ℃條件下保持10 min，之后以1 ℃/min的速率連續冷卻到-55 ℃，最后在-80 ℃的冷凍機中貯藏24 h，結果發現，可使凍融紅細胞的相對存活率提高20%。近幾年低磁場在食品冷凍領域被廣泛研究及應用，例如：在冷凍過程中，對牛肉施加磁場使其發生共振干擾了水分子結晶，顯著降低了冰晶的增長速率和肉品的解凍損失；施加2 mT的靜磁場，在-20 ℃條件下冷凍48 h后進行凍融實驗，發現其可以顯著保護冷凍面團免受冷凍損傷，使得谷蛋白結構更加穩定（解聚率降低24.26%）；使用15.98 mT的永久磁場處理MP，發現其成核溫度、相變時間和過冷時間分別降低2.79 ℃、1.76 min和0.80 min，這均證明了磁場有利于提高食品質量和降低能耗。

本研究主要通過測定表面疏水性、巰基含量、溶解度、濁度、熱穩定性、傅里葉變換紅外光譜、內源熒光光譜和紫外吸收光譜，研究低磁場冷凍對鰱魚MP功能和結構變化的影響，為低磁場技術在食品冷凍和保鮮中的應用、進一步研究該技術與保鮮劑、抗凍劑等協同作用及相關產品的消化特性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱魚，購于遼寧省大連市熟食品交易中心。

三羥甲基氨基甲烷（tris-hydroxy-methy-laminomethane，Tris） 青島捷世康生物科技有限公司；氯化鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司；尿素、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團化學試劑有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid sodium，ANS）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）天津致遠化學試劑有限公司；乙醇 天津北聯精細化學品開發有限公司；溴化鉀（光譜純） 天津大茂化學試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BL-310電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；UV-9000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；MFl-F1磁場冷凍冷藏箱 英都斯特（無錫）感應科技有限公司；TD5A-WS立式高速冷凍離心機湖南赫西儀器裝備有限公司；PHSJ-4F精密數顯pH計山東晨拓科學儀器有限公司；Synergy H1/H1M酶標儀美國伯騰儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司；SL-Ⅲ數控層析冷柜、Scientz-30D真空冷凍干燥機 寧波新芝科技股份有限公司；Q20差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司；NEXUS670紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司； BCD-336WDPC冷藏箱 青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚MP的提取

參考李學鵬等的方法進一步修改。選取鰱魚背部白肉，加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2、4 ℃），均質15 s后于5 000 r/min離心15 min，取沉淀加入4 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、pH 7.2、4 ℃）混勻，均質10 s后于4 500 r/min離心20 min，取上清液用雙縮脲法測定MP質量濃度。

1.3.2 樣品冷凍處理

將提取的鰱魚MP使用MFl-F1磁場冷凍冷藏箱采用2 mT低磁場（low magnetic field，LMF）結合-20 ℃冷凍，記為LMF組，0 mT磁場（no magnetic field，NMF）結合-20 ℃冷凍，記為NMF組，作為空白對照，用BCD-336WDPC冷藏箱-30 ℃常規冷凍（conventional freezing，CF），記為CF組，作為陽性對照，冷凍時間為28 d。表1為不同組別MP的凍藏條件。在測定各項指標之前，樣品在4 ℃解凍過夜。

表 1 MP凍藏條件Table 1 Freezing conditions for MP

1.3.3 表面疏水性和巰基含量測定

表面疏水性的測定參考Shui Shanshan等的方法進一步修改。制備質量濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的MP溶液，取2 mL溶液與10 μL ANS（含10 mmol/L ANS、20 mmol/L Tris，pH 7.5）充分混勻，避光冷藏（4 ℃）10 min。設置參數：激發波長375 nm，發射波長485 nm，增益50。以熒光強度為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，斜率代表表面疏水性。

總巰基含量的測定參考Zhang Bin等的方法進一步修改。取5 mg/mL的MP溶液0.5 mL，加入4.5 mL緩沖液（含0.2 mol/L Tris、8 mol/L尿素、2 g/100 mL SDS，10 mmol/L EDTA，pH 6.8），取4 mL混合液與0.4 mL DTNB溶液混合，將溶液40 ℃水浴25 min后在412 nm波長處測定吸光度。

活性巰基含量的測定參考Hu Xin等的方法進一步修改。取0.5 mL 5 mg/mL MP溶液與4.5 mL緩沖液（含0.2 mol/L Tris、10 mmol/L EDTA，pH 6.8）混合，取2.5 mL混合液加入0.25 mL DTNB溶液，1 h避光反應（4 ℃）后在412 nm波長處測定吸光度?？値€基含量、活性巰基含量和二硫鍵含量分別按式（1）～（2）計算。

式中：為除去空白試劑后樣品于412 nm波長處吸光度；為稀釋倍數；為MP質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4 溶解度和濁度測定

參考Amiri等的方法，取0.5 mL 5 mg/mL的MP溶液，用雙縮脲法測定5 500 r/min、15 min離心前后的質量濃度。溶解度按式（3）計算。

式中：為離心后上清液MP質量濃度/（mg/mL）；為離心前MP質量濃度/（mg/mL）。

參考嚴紅波等的方法進一步修改。將1 mg/mL的MP溶液混勻，靜置20 min，在340 nm波長處測定吸光度表示濁度。

1.3.5 熱穩定性測定

參考Liu Shulai 等的方法進一步修改。取10 mg/mL的MP溶液，置于鋁制坩堝進行稱量（樣品稱量范圍為12.0～18.0 mg），后壓蓋密封，以空坩堝為空白，在40～80 ℃溫度掃描范圍下，以10 ℃/min的升溫速率進行掃描。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜測定

參考藍蔚青等的方法進一步修改。將0.002 g凍干樣品與0.1 g干燥后的固體溴化鉀混合。設置參數：分辨率4 cm，掃描范圍500～4 000 cm，掃描次數40 次。對混合物進行光譜分析，用Peakfit軟件對酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm）進行擬合，計算二級結構相對含量。1.3.7 內源性熒光光譜和紫外吸收光譜測定

參考Niu Jianzhen等的方法進一步修改。使用熒光分光光度計對1 mg/mL MP溶液進行掃描，設置參數：激發波長295 nm，掃描范圍300～450 nm。

參考Qiu Chunjiang等的方法進一步修改。使用紫外-可見分光光度計對1 mg/mL MP溶液進行掃描，以Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2）作為對照，掃描范圍190～700 nm。

1.4 數據處理

所有指標數據均進行3 次平行實驗，結果用平均值±標準差表示。用Origin 2021軟件進行數據繪圖。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan’s法分析數據間差異顯著性，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同冷凍處理對MP表面疏水性和巰基含量的影響

表面疏水性是評價蛋白質變性的一個重要指標，可以反映蛋白質中疏水氨基酸殘基含量。由圖1A可知：LMF組的表面疏水性顯著低于NMF組（＜0.05），說明凍藏期間施加低磁場可以顯著抑制蛋白質疏水基團的暴露，其原因可能是磁場條件下，水分子傾向于重新定向和有序排列，從而在冷凍過程中實現固定傳熱，形成細小、均勻、光滑的冰晶，保護細胞免受破壞，從而使疏水基團的暴露減少；CF組的表面疏水性顯著低于NMF組（＜0.05），說明相同冷凍條件下，冷凍溫度越低，抑制蛋白質疏水基團暴露的能力越大，這一發現與李學鵬等的研究相似，在-80 ℃凍藏條件下，大黃魚的表面疏水性緩慢增加，且比-18 ℃的上升幅度??；LMF組（-20 ℃）與CF組（-30 ℃）并無顯著差異，說明針對MP的表面疏水性，2 mT的低磁場作用可以節約10 ℃的冷凍溫差，達到減少能源消耗的目的，這可能是由于低磁場能夠加速樣品冷凍降溫過程導致的。

圖 1 不同冷凍處理MP的表面疏水性（A）和總巰基、活性巰基及二硫鍵含量（B）Fig. 1 Surface hydrophobicity (A) and total sulfhydryl, active sulfhydryl and disulfdie bonds contents (B) of MP with different freezing treatments

巰基被認為是蛋白質中最具活性的官能團之一。隨著蛋白質結構的展開，埋入蛋白質中的巰基可能暴露在表面，并被氧化成二硫鍵，導致巰基含量降低。由圖1B可知，LMF組的總巰基和二硫鍵含量顯著高于NMF組（＜0.05），分別提高21.3%和24.4%，活性巰基含量差異不顯著。Wu Di等發現，3 mT直流磁場可以使低鹽MP凝膠的總巰基含量從1.58 μmol/g顯著增加到3.21 μmol/g（＜0.05），其原因是低磁場破壞了蛋白質分子中原有的二硫鍵，分子間二硫鍵的斷裂使一些碎片分子聚集和重排，最后使得總巰基含量增加。最初埋藏在MP中的活性巰基在磁場作用下逐漸暴露到MP表面，導致活性巰基含量升高，然而也不排除分子間二硫鍵斷裂的可能性；NMF組的總巰基含量略低于CF組，活性巰基含量顯著高于CF組（＜0.05），二硫鍵含量顯著降低（＜0.05），說明常規冷凍處理可以使得大量的活性巰基被氧化轉變為二硫鍵，這是因為低溫冷凍引起的蛋白質濃縮效應增加了分子間二硫鍵的交換反應，最終使得蛋白質變性；LMF組的總巰基和活性巰基含量顯著高于CF組（＜0.05），二硫鍵含量明顯高于CF組，說明低磁場可以減緩活性巰基向二硫鍵轉變，延緩MP變性?？傊?，低磁場會減小MP活性巰基含量的下降程度，從而抑制氧化，減少二硫鍵生成，使得MP變性程度減小。

2.2 不同冷凍處理對MP溶解度和濁度的影響

圖 2 不同冷凍處理MP的溶解度（A）和濁度（B）Fig. 2 Solubility (A) and turbidity (B) of MP with different freezing treatments

溶解度是蛋白質重要的功能性質之一，蛋白質的變性和聚集會影響其溶解度的大小。由圖2A可知：LMF組的MP溶解度顯著高于NMF組（＜0.05），說明低磁場冷凍延緩了MP溶解度的降低，改善了MP的功能性質；CF組略高于NMF組，這與Badii等的研究結果一致：低溫可以使蛋白質溶解度下降速率減慢；LMF組與CF組相比，溶解度顯著增加1.04%（＜0.05），說明低磁場會促進MP溶解，這一結果與表面疏水性的結果一致?？偟膩碚f，低磁場冷凍會抑制MP中的疏水基團從內部暴露，增加了表面疏水性，減緩其變性程度，從而使得MP溶解度升高。

濁度是衡量MP聚集程度的指標。由圖2B可知：LMF組的濁度顯著低于NMF組（＜0.05），降低4.44%，說明低磁場可以延緩MP氧化，延緩聚集的形成；CF組和NMF組的濁度差異不顯著，但CF組的濁度更大，冷凍引起的MP氧化會導致MP中的官能團融合，從而形成聚集，使得濁度增加，說明-30 ℃的低溫加劇了MP的聚集反應；與CF組（-30 ℃）相比，LMF組（-20 ℃）的濁度顯著降低（＜0.05），這一結果與溶解度結果一致，說明低磁場可以促進MP溶解，延緩MP的聚集，且效果非常明顯。

2.3 不同冷凍處理對MP熱穩定性的影響

表 2 不同冷凍處理MP的變性溫度（Td） 與變性焓（ΔH）Table 2 Denaturation temperature (Td) and enthalpy (ΔH) of MP with different freezing treatments

和Δ是蛋白質熱穩定性的重要指標。由表2可知，LMF組的顯著高于NMF組和CF組（＜0.05），分別增加20.13%和32.61%，說明低磁場可以顯著提高MP的熱穩定性（＜0.05）。由于施加低磁場會使分子內氫鍵受到影響，水團破碎，從而造成自由水簇的減小，增加非凍結合水含量，從而保持其良好的熱穩定性。NMF組的顯著高于CF組（＜0.05），這與Qian Shuyi等的研究相反，其認為冷凍溫度越低，越高，原因可能是設備不同所造成的誤差，還需進一步研究。此外，Δ也可表示蛋白質變性所需的能量。NMF組的Δ顯著高于LMF和CF組（＜0.05），說明NMF組的抗變性能力較強，所需的能量較少；LMF組和CF組的Δ無顯著差異，表明低磁場冷凍和常規冷凍在誘導蛋白變性時需要相似的能量，而在這2 種冷凍方式下，LMF會節省10 ℃的冷凍溫差，從而減少能源消耗，因此，選擇低磁場更符合當下市場的要求。

2.4 不同冷凍處理對MP傅里葉變換紅外光譜的影響

傅里葉變換紅外光譜是觀察蛋白質二級結構變化的重要方法。蛋白質的酰胺鍵有幾種不同的振動模式，其中蛋白質二級結構（-螺旋、-折疊、-轉角和無規卷曲）主要由酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm）引起C＝O伸縮振動。鰱魚MP在500～4 000 cm的紅外光譜如圖3A所示。對不同冷凍處理的MP紅外光譜進行擬合，根據-螺旋（1 650～1 660 cm）、-折疊（1 600～1 640 cm）、-轉角（1 660～1 700 cm）和無規卷曲（1 640～1 650 cm）的特征峰識別MP經冷凍后的二級結構含量，結果如圖3B所示。已有文獻報道，-螺旋結構主要由多肽鏈的羰基氧（-CO）和氨基氫（-NH）之間的氫鍵維持，這些氫鍵會受到冷凍過程中物理效應（水分遷移、蛋白質的機械損傷和冰結晶）的影響而被干擾或破壞，使得蛋白質構象不穩定。

圖 3 不同冷凍處理MP的傅里葉變換紅外光譜（A）和二級結構含量（B）Fig. 3 Fourier transform infrared spectra (A) and secondary structure content (B) of MP with different freezing treatments

由圖3A可知：1 645 cm附近的特征吸收峰是酰胺Ⅰ帶C＝O的伸縮振動，1 548 cm附近的特征吸收峰是酰胺Ⅱ帶C-N的伸縮和C-H的彎曲；對比NMF組的紅外譜圖，經低磁場處理后的MP紅外光譜中特征峰明顯增強，表明低磁場可以保護MP結構免受破壞并抑制二級結構的轉化。由圖3B可知：與NMF組相比，LMF組的-螺旋含量相對較高，而-折疊含量較低，且-轉角和無規卷曲含量相同。這與Zhou Hongling等研究的直流磁場冷凍對面團中谷蛋白二級結構的影響結果相似，證明低磁場能夠抑制蛋白-螺旋結構的展開，從而減弱其轉換成-折疊結構的作用，保持MP在冷凍期間的二級結構穩定性。NMF組的-螺旋含量高于CF組，提高22%；CF組的-轉角和無規卷曲含量總體上高于LMF組，并且這2 種結構含量代表著蛋白質的聚集程度，說明經常規冷凍處理后，MP結構變得松散且不穩定，而低磁場冷凍可以更好維持MP二級結構的穩定性。這些結果表明，使用低磁場對MP進行冷凍處理，可以減少MP的損傷，抑制-螺旋結構的展開，證明MP變性程度更小，構象更穩定。且經過低磁場冷凍處理的MP氧化程度降低，活性巰基含量的變化同樣證實了這一點。猜測由于低磁場改變了冰晶的形態，抑制了冰晶的生長，減少了冷凍過程中冰結晶的干擾破壞，維持一定的二級結構穩定性，但還有待進一步實驗驗證。

2.5 不同冷凍處理對MP內源性熒光和紫外吸收光譜的影響

圖 4 不同冷凍處理MP的內源性熒光光譜（A）、最大熒光強度（B）和紫外吸收光譜圖（C）Fig. 4 Endogenous fluorescence spectra (A), maximum fluorescence intensity (B)and UV absorption spectra (C) of MP with different freezing treatments

熒光強度通常受熒光能量照射影響，主要通過芳香族氨基酸（主要是色氨酸）的照射量來確定MP的三級結構變化。有研究報道，鹽溶性MP的冷凍變性是因其分子間共價鍵或非共價鍵的形成而導致的聚集變性。由圖4A可知，NMF、LMF和CF組的最大發射波長并沒有發生移動，說明在不同的冷凍方式下，色氨酸所處的極性環境并不會發生變化。由圖4B可知：NMF、LMF和CF組的最大熒光強度分別為211.93、210.6和285.67；LMF組的最大熒光強度與NMF組并無顯著差異，說明無論低磁場是否存在都顯示出較低的熒光強度；與CF組相比，LMF和NMF組的熒光強度顯著降低（＜0.05），分別下降35.6%和34.8%，說明不同的冷凍溫度和低磁場冷凍均可延緩MP的聚集變性，但低磁場的效果更明顯。

色氨酸和酪氨酸的殘基側鏈可以在紫外吸收光譜中產生相應的吸收峰。由圖4C可知：MP在270～280 nm附近有特征吸收峰出現，LMF組和NMF組的吸收強度并無明顯差異；與CF組相比，LMF組和NMF組的吸收強度均降低，一方面是由于冷凍溫度所引起的，冷凍過程中MP聚集體的形成使暴露在外面的顯色氨基酸基團再次被隱藏，導致NMF組的紫外吸收強度明顯降低，且有研究表明，冷凍產生的冰晶會破壞蛋白質的三級結構，將部分埋藏的氨基酸殘基暴露，導致吸收強度升高，因此，猜測另一方面的原因可能是磁場冷凍導致水分子傾向于重新有序排列，形成的冰晶可以減少對細胞的破壞，使氨基酸基團減少暴露，導致LMF組的吸收強度降低，表面疏水性的結果也證實了這一點。此外，LMF組的下降幅度較小，說明低磁場冷凍能維持MP三級結構的穩定性，氧化過程中巰基含量的降低也證明了低磁場可以維持三級結構的完整性。

3 結 論

研究低磁場冷凍對鰱魚MP的影響，發現低磁場（-20 ℃、2 mT）處理可抑制MP內部殘基的暴露和重排，并對蛋白結構有一定的保護作用。結果表明：與0 mT磁場冷凍相比，低磁場冷凍處理可以延緩表面疏水性升高，抑制疏水基團的暴露，也可以減緩活性巰基氧化成二硫鍵，保持結構的完整性，溶解度和濁度的結果同樣證明了低磁場冷凍可以抑制MP的聚集，使MP具有良好的功能特性，低磁場冷凍還可以保持較高的熱穩定性和二、三級結構的穩定性；常規冷凍處理同樣也使得表面疏水性、活性巰基含量和熱穩定性顯著降低，而總巰基含量、溶解度和濁度無顯著差異，且有更多的-螺旋轉變為-折疊，使得MP結構不穩定；而0 mT磁場冷凍和常規冷凍處理之間內源性熒光光譜、紫外吸收光譜指標并無顯著差異，說明0 mT磁場冷凍可以節約10 ℃的冷凍溫差，減少能源損耗，以上結果可以說明低磁場冷凍比常規冷凍更適合用于MP冷凍，且是一種環保、減能的冷凍技術。

低磁場冷凍（2 mT）對同等條件下0 mT磁場冷凍的MP熒光強度和紫外吸收強度的影響并不顯著，有待進一步實驗驗證。低磁場冷凍可以減少MP的氧化、聚集和變性，使MP的構象更穩定，并為低磁場冷凍工業化提供了基礎依據，也為進一步研究該技術與保鮮劑、抗凍劑等協同作用及相關產品的消化特性提供了基礎數據。