植物-土壤的交互作用：腐殖質的作用

Serenella Nardi，Andrea Ertani，Ornella Francioso 著 楊 輝 侯翠紅* 關紅玲 譯

1 帕多瓦大學農學、食品、自然資源、動物與環境學系 意大利帕多瓦 35020

2 博洛尼亞大學農業科學系 意大利博洛尼亞 40127

3 鄭州大學化工學院 鄭州 450001

腐殖質（HS）包括腐植酸（HA）和黃腐酸（FA），是水體、土壤和大氣中有機碳（C）的主要成分，具有很強的抗分解性。HS通常被認為是有機碳中最活潑的部分，因為它們包含許多諸如羧基（-COOH）或酚羥基（-OH）的官能團。在土壤中，這些基團使HS與礦物緊密結合，控制金屬的形態和溶解度。有機礦物復合物可防止微生物的攻擊，因此HS是穩定的，不易降解，有利于土壤有機碳的循環和固定。

土壤HS在自然和農業生態系統中具有多重生態任務：可以通過螯合礦物質和自身降解提供養分，作為有效有機碳的主要來源構建土壤生物群落。能夠決定土壤的健康程度和肥力高低。此外，HS通過誘導植物形態變化、改變微量和大量營養元素的吸收并通過生化途徑來影響植物代謝。HS的分子結構及其在植物代謝中的生物活性機制研究取得了重大進展?？扇苄訦A生物肥料的利用并不是新的研究方向，并且有機農業相對傳統農業的擴張有利于促進作物生長的生物刺激劑的市場發展。HA鹽等生物刺激素對環境和人類健康有相當大的影響。因此，在不久的將來，HA鹽的使用是作物生產的可持續解決方案。本綜述不僅討論了HS對植物生長的影響，同時探討了HS如何從環境向植物傳遞信息以提高植物的適應能力。

1 腐殖質的結構

Corrado等詳細論述了HS結構的復雜性及其生物活性。因此，本綜述只簡要概述其主要結果。雖然HS主要的分子結構單元（脂肪鏈、醌類、酚類和類糖基團）已經被確定，但結構單元的組織形式存在爭議。不同的來源環境造成的HS異質性增加了化學成分的可變性。分區模型和聚合物分布模型已被用來表征HS分子結構。然而，相關的實驗研究將HS描述為相對小分子的異質超分子混合物，通過相對較小的有機分子之間的非共價相互作用（如π-π、CH-π、范德華力、電荷轉移和氫鍵）或通過具有疏水內部的小膠束結構（避免與鄰近的水分子接觸）結合在一起。外部親水結構域由極性基團（如羧酸）組成，而內部疏水結構域由植物大分子組成。由于分子間的相互作用非常弱，當在不同pH值下使用有機酸（一元、二元、三元羧酸）處理時，膠束很容易被分解成不同的較小的聚合物。這些聚合物可能會重新形成膠束，并且膠束化和解聚可能會永續下去。Piccolo發現親水/疏水比率影響HS在環境中的反應性。

HS的結構主要通過對pH值變化的反應分級成HA和FA進行研究的。在堿性條件下（圖1），由于分子內的氫鍵被完全破壞，HS以分散形式存在。在弱酸性條件下，由于弱的非共價鍵相互作用（范德華力、π-π、CH-π）被破壞，HS表觀分子尺寸顯著減小或被分解。在pH〈3時，由于羧酸基團的質子化有利于HS大分子內和分子間氫鍵的數量增加，HS被破壞（圖1）。根分泌弱有機酸釋放到土壤溶液中，新的氫鍵的形成和疏水相互作用的破壞可能有利于HS小聚合物的生物有效性。此外，羧基的性質和分布對確定HS的溶解度和生物反應性尤為重要。

圖1 土壤腐殖質在不同pH值水溶液中的表面增強拉曼散射（SERS)光譜Fig.1 Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra of soil HS in water solution at different pH values

目前，關于土壤有機質的性質和形成已有不同的理論。Grahams等利用先進的分析技術獲得的實驗觀測結果表明，在土壤中無法檢測到“HS”。此外，Lehmann和Kleber提出了土壤連續體模型（SCM），認為“有機物是逐步分解有機化合物的連續體”。在這個框架下，土壤有機質從完整的植物到富含羧酸的有機碳均包含一系列的物質。SCM對有機物的性質給出了完整的解釋，正如應用光譜顯微技術進行原位表征所示，并未涉及“HS”。基于可觀測證據的SCM為模擬土壤碳動力學和土壤管理提供了一種先進的方法。

2 腐殖質結構與生物活性的關系

HS結構與生物活性的關系對了解其在植物中的生物學效應及其利用具有重要意義。首先，HS活性與所產生效應之間的關系是一個復雜的現象。當比較不同來源的HS的生物活性時，期望具有相同的效應和相同的作用機制。然而HS可能通過不同的作用機制產生類似的效應。例如，黑松植物的碳代謝是由富含甲基（-CH3）和羧基（-COOH）的土壤中提取的HS引發的（圖2），而來自富含芳香碳和羧基的蚯蚓糞堆肥材料的HS有利于玉米植株側根的形成。存在研究顯示，HS中高水平濃度的羧基抑制了大麥根對硫酸鹽的吸收。

圖2 高和低分子量腐殖質的1H NMR譜圖（4.2～2.0 ppm范圍）Fig.2 1H NMR spectra (4.2～2.0 ppm range) of high (HMW) and low (LMW) molecular weight HS

考慮特定官能團對生物活性的影響與不同分子量（MW）組分的關系。Nardi等將HA分成3個組分，降低分子大小以發現其結構與生物活性之間的關系。結果表明，在表觀分子大小、分子特征和用量影響下，未分級的HA和3個組分對糖酵解和三羧酸循環（TCA）相關酶的影響大小如下：III〈HA〈II〈I。無論是單獨存在還是在未分級的HA中，組分III的最佳效果都可能與靈活的構象有關，這種構象使生物活性HA組分更有效地擴散到玉米細胞中。相反，Canellas等并沒有發現HS生物活性與表觀分子量分布之間的相關性。Garc?á等描述了HS的結構-性質-功能關系來解釋其在植物中的生物活性。分析37個HS組分得出結論：“生物活性的主要差異在于HS結構，其可被理解為超分子結構”。作者還證明了HS的抗逆性和不穩定性是確定植物根構型刺激的重要參數。根的長度和較小的根的形成受脂肪鏈結構中氧、氮的存在的調節，而較大的根的生長與更復雜的結構有關，如脂肪族和芳香基團。

3 腐殖質在離子吸收中的作用

由于HS復雜性和特征的不完全性，其對根中離子轉運的影響不易解釋。此外，HS由于土壤來源和提取方法的不同而很難對其進行比較。HS對離子吸收具有選擇性作用，其影響程度與HS濃度、植物個體、土壤組成和pH值有關。HS可能對植物的功能有多種影響，其中一些可能直接或間接地導致離子吸收性能的改變。此在轉錄（6-甲基嘌呤）和翻譯（環己酰亞胺）抑制劑的實驗中得到了證實。Dell’agnola等證明HS在轉錄后水平上促進了大麥根中載體蛋白的合成。Nardi等將低分子量腐殖質組分（LMW）應用于玉米幼苗，觀察信使RNA數量的變化。研究發現LMW對多肽合成具有轉錄后效應，從而影響植物整體營養。這一機制與現有研究一致，表明HS（HMW和LMW組分）通過促進硝酸鹽載體蛋白的表達和改變一些動力學參數來促進NO3-的吸收。此外，Nardi等研究表明，LMW處理的玉米幼苗也增加了對硝酸鹽的吸收，并強烈抑制了玉米微粒體中H+釋放和ATP酶。

LMW未通過影響溶質初次運輸來促進硝酸鹽的吸收，但可能降低了根表面的pH值，從而促進了H+/NO3-的共轉運。LMW可與轉運蛋白相互作用（精細調控），間接調節NO3-的吸收，在根和培養的胡蘿卜細胞中，它可以到達質外體并與質膜相互作用。HS對轉運蛋白作用主要來自于HMW和LMW對微粒體部分K+-ATP酶活性的刺激（推測與質膜H+-ATP酶一致）。HA還能促進暴露于釩酸鹽的根的質子釋放，但這種增加只在培養24 h后才顯現。LMW還能加強離體質膜中的H+-ATP酶活性，增加質子梯度并刺激吸收。

Quaggiotti等在LMW處理48 h后的玉米根中發現編碼低親和硝酸鹽轉運體（ZmNrt1.1）或高親和硝酸鹽轉運體（ZmNrt2.1）的基因轉錄積累沒有增加。其他硝酸鹽轉運體可能參與其中，但HS處理后硝酸鹽吸收的增加可能反映了zmNrt2.1轉錄后/翻譯后調控機制和（或）間接吸收調節。此效應可能依賴于H+-ATP酶的作用，產生了跨越質膜的質子梯度，對營養吸收是必不可少的。在這種梯度作用下，植物可能通過次級主動運輸獲得硝酸鹽。此外，LMW處理48 h的玉米幼苗在根中積累了Mha2的轉錄，表明H+-ATP酶的這種主要的玉米亞型表達是被強烈誘導的。

Agure等證明從風化褐煤中提取的沉積HA增加了根對鐵的吸收，并提高了參與鐵吸收的基因表達，包括鐵（III）螯合還原酶（CsFRO1）、鐵（II）-根轉運蛋白（CsIRT1）和質膜H+-ATP酶（CsHA2）。Jannin等利用微陣列分析觀察到，泥炭HA在油菜根部施用3天后，對地上部720個基因和根部366個基因產生了影響。隨著初級硝酸鹽（BnNRT1.1，BnNRT2.1）和硫酸鹽（BnSultr 1.1，BnSultr 1.2，BnSultr 4.1，BnSultr 4.2）根轉運體的表達，根對硝酸鹽和硫酸鹽的吸收均增加。Mora等在黃瓜中觀察到類似的結果，沉積的HA可能是通過提高質膜H+-ATP酶的活性，增加了根對硝酸鹽的吸收，從而促進了細胞分裂素從根向地上部的轉運。

4 植物-土壤的交互作用

植物存活和作物產量很大程度上依賴于根、微生物活性和土壤組分之間相互作用對不同環境的適應能力。植物-土壤相互作用的研究主要集中于發生在根際的過程。這些過程對于植物吸收養分和抵御病原菌侵襲至關重要。

目前有關根的生物學、生物化學和遺傳發育的研究較為充足。相比之下，根際中以根介導的生物過程，如根緣細胞和根分泌物的分泌、碳向根相關共生體的流動、根細胞的死亡和裂解等研究匱乏。

然而，植物的根具有向根際分泌大量化合物的能力：大約5%～21%的光合作用所固定的碳通過根分泌物轉移到根。植物根分泌物在不同植物種類之間存在差異，這對微生物和土壤動物組成以及土壤物理、化學和生物地球化學性質有相當大的影響。生長中的植物通過排泄、分泌、脫落和根死亡將有機化合物釋放到根際，從而產生與碳循環相關的微生物活性熱點，尤其是土壤有機質（SOM）的形成和分解。根分泌物的數量和類型以及土壤的內在特性影響著碳流量的大小和方向。

研究表明，土壤碳礦化是由根分泌物從礦物-有機結合體中釋放碳的能力決定的。由于它們限制了微生物和酶的通路，礦物有機結合成為了最重要的碳保護機制。雖然土壤的化學性質（如pH值）對根的生長和礦質養分的有效性非常重要，但礦質養分的吸收取決于根際條件以及根對這些條件的改變程度。根分泌物可通過酸化根、溶解吸附或沉淀陽離子、分泌有機陰離子（螯合劑）等途徑直接調動礦質養分，增加養分吸收。

低分子量有機酸在土壤成因和植物生長中發揮著重要作用。它們由土壤生物（少量）、根和發芽的種子（大量）產生和釋放。有機陰離子根分泌物在植物-根-微生物相互作用中作為識別信號或植物激素產生的前體引起了人們的廣泛關注。Nardi等致力于選擇適當的分離和分級HS的方法，并采取適合于識別真正植物反應跡象的程序。用0.1 mol/L KOH提取HS，通過模擬根分泌物的作用進行分級，并通過滲析分離。研究發現，植物根分泌物中存在的簡單有機陰離子可能會影響來自土壤HS的物理化學排列。直接起作用的似乎只有與植物吸收相容的LMS。在自然存在的HS物質中，宏觀結構上LMS通常與高分子量腐殖質組分（HMS）聚合。

因此，在簡單有機酸的作用下，根-土壤界面上發生的LMS-HMS結構的解離可能是HS直接生物作用的先決條件。在實驗室過程中，通過有機酸處理將HS提取物分離為明顯的低（〈3.5 k）和高（〉3.5 k）分子量組分，分別為LMS和HMS，這2種組分具有不同的類激素活性。為了闡明來自土壤和HS提取物的LMS和HMS誘導釋放激素活性的條件，擴大了研究范圍。在土壤直接酸化得到的上清液中未檢測到類激素活性，而在先前用乙酸或鹽酸酸化的HS提取物滲析產生的溶液中檢測到類激素活性。0.1 mol/L KOH的提取只能釋放類細胞分裂素的活性，而類生長素和類赤霉素的活性仍然與HS提取物結合，分別在pH值為7.5～4.2和4.2～2.5，經乙酸和鹽酸酸化后，類生長素和類赤霉素活性幾乎完全釋放（表1）。

表1 3個玉米品種的干重及其用于土壤提取的根分泌物組成Tab.1 Dry weights of three maize cultivars and the composition of their root exudates used for soil extraction

結果表明，HS類激素活性的釋放首先通過反絮凝作用使膠束破裂和HS增溶（pH 11），然后主要通過有機酸處理（pH 2.1）獲得解聚。第1個過程（反絮凝）只釋放類堿性磷酸酶活性，而第2個過程（解聚）釋放吲哚乙酸和類赤霉素活性。另一研究表明，玉米幼苗的分泌物參與了從土壤中提取HS的過程，HS提取的質量和數量取決于植物獲取養分的方式，并受到釋放有機陰離子的調節。在尺寸排除色譜中，3個玉米品種幼苗根分泌物中的有機陰離子（富馬酸鹽和琥珀酸鹽）將HS從高分子量轉移到低分子量（表1和表2）。農業和森林分泌物也用于分離土壤有機組分。與目前使用的堿性溶液相比，根分泌物可能是提取生物活性低分子量（LMW）有機組分更好的介質。

表2 尺寸排除色譜法洗脫腐殖質溶液的特性Tab.2 Characteristics of humic solution eluted by size-exclusion chromatography

Nardi等比較玉米、云杉和樟子松的根分泌物作為提取劑獲得的LMW組分與用KOH溶液從農業和森林中提取的HS的生物活性。氣相色譜/質譜結果顯示，LMW組分相對于HS具有大量的脂肪酸，而傅里葉變換紅外光譜則顯示了LMW組分與HS具有不同數量的官能團。從類激素活性、硝酸鹽吸收和氮代謝等方面評價了樟子松LMW組分與HS的生物活性。來自農業土壤LMW組分提高了硝態氮的吸收、硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，來自森林土壤LMW組分促進了銨態氮的吸收、NR和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性。這些結果表明，LMW組分的化學組成和土壤類型對氮代謝途徑有顯著影響。因此，LMW組分是根分泌物的重要組成部分，通過提高的大量和微量營養物質的生物有效性來促進生物活性。

Pizzeghello等對59種不同類型的歐洲山毛櫸林下的土壤進行了研究，以評估不同植被類型對未溶解和溶解土壤有機質的化學組成和生物活性的影響。采用主成分分析（PCA）方法，分析了各類型間的數據差異。觀察到酸性山毛櫸林的HS與類生長素活性相關，而中性山毛櫸林的HS與類赤霉素活性相關。如先前體外實驗所示，土壤pH值和不同的類激素活性之間存在明顯的相關性。酸性土壤刺激植物類生長素物質的活性，這些物質在植物根的形成和發育等一系列活動中發揮著重要作用。相反，中性或堿性土壤更有利于類赤霉素活性。

Nardi等在意大利北部2種銀杉更新程度不同的森林土壤的溶解有機質（DOM）中發現了植物-土壤交互作用。通過不同濃度的脂肪酸、酚酸和無機營養物質以及類激素活性對DOM進行了表征。結果表明，在銀杉種群增長豐富的地方，DOM和HS中都存在脂肪酸、酚酸和類激素活性。相反，在銀杉種群增長差的地方，DOM和HS活性分子濃度較低。

Canellas等探索分子質量的動態變化和有機酸存在時HA的生物活性的變化，發現施用HA和檸檬酸的玉米幼苗根面積、主根、根數量、根密度和質膜ATP酶均發生了變化。此外，添加HA的幼苗根分泌圖顯示草酸的分泌量增加，蘋果酸和琥珀酸的分泌量減少。表明了HA與植物之間存在一種交互作用：根中的有機陰離子的分泌受到根發育過程中HA釋放的生物活性分子的影響。

綜上所述，可以認為，植物通過分泌物能夠從土壤中提取對其代謝有積極影響的活性組分和（或）分子。這些組分的作用與HS相同，但它們的化學和生物學特征尚不足以說明它們與堿溶液提取的HS是否相似或不同，或者它們是否代表HS的1個組分。在這種情況下，Lehmann和Kleber提供了關于HS相關概念的非常關鍵的觀點，通過根分泌物證實HS代表土壤有機質。在此觀點的基礎上，Scaglia等提出，來自植物殘體和（或）微生物的分子通過自組裝形成具有生物活性的HS。

5 腐殖質生長素效應

HS可誘導生長素的典型生理效應，如前所述，在其結構中可檢測到生長素。一些研究者使用了不同的方法來記錄HS結構中的吲哚乙酸分子。Pizzeghello等使用免疫分析法從森林土壤、堆肥和蚯蚓糞中的HS中鑒定吲哚乙酸。一系列植物種類的數據表明，生長素的特異性抑制劑（2，3，5-三碘苯甲酸和4-氯苯氧異丁酸）和抗吲哚乙酸抗體可以抑制HS的生物活性。Zandonadi等研究表明，HS對生長素作用的特定分子靶點有誘導作用。HS刺激生長素早期應答基因IAA5和IAA19的表達，并誘導質膜H+-ATP酶的合成、活性和表達。

Ertani等研究了糞肥和礦物施肥對蚯蚓糞便中HS的光譜和生物學特征的長期影響，發現不同施肥措施與從蚯蚓糞中提取的HS的類生長素活性之間存在關系。在高山環境中進行的1項研究發現，雪田鼠的群體引起了有機物轉換的劇烈改變，這決定了腐殖化過程的普遍性。這種土壤有機質循環產生的HS具有較高的類生長素活性。

Tahiri等研究了垃圾滲濾液和風化褐煤HS對榿木和樺樹根伸長過程中生長素、碳、氮途徑及脅迫條件下的生物活性。結果表明，HS及其HA組分通過調節ABCB轉運蛋白（ABCB1和ABCB19）轉錄水平，影響生長素極性運輸（PAT）促進根生長。這些數據證實了HS通過促進碳、氮代謝和脅迫反應促進植物生長發育。

Aguirre等研究采用純化沉積的腐殖質（PSHS），未檢測到包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、細胞分裂素、脫落酸、赤霉素的植物生長調節劑的可檢測濃度，發現PSHS在轉錄水平和轉錄后水平影響根和地上部的功能。HS除了通過與吲哚乙酸連接的途徑促進根和地上部生長外，還可能存在其他的補充途徑或獨立于生長素或類生長素結構位點的途徑。這些新的互補途徑可能與HS促進根對硝酸鹽、硫酸鹽和鐵的吸收密切相關。PSHS可能通過改善根對硝酸鹽的吸收和根-地上部間的轉運來影響地上部的生長。

Mora等研究得出，PSHS促進了黃瓜地上部生長、根對硝酸鹽的吸收以及硝酸鹽、細胞分裂素和礦質營養物質的根-地上部間運輸。Jannin等利用基于微陣列的油菜籽轉錄和生理研究證明，HS通過根對硝酸鹽吸收和細胞分裂素功能之間的關系影響地上部的發育。施用PSHS可提高根對硝酸鹽和硫酸鹽的吸收和相應的根轉運蛋白的基因表達。PSHS顯著地改變了參與調節與礦質營養、激素合成和信號傳導（細胞分裂素和赤霉素）、細胞發育和光合作用相關的許多代謝和生理功能的根冠基因的表達。PSHS對根中一氧化氮、吲哚乙酸、乙烯和脫落酸濃度的影響表明，這些植物生長調節劑可能與HS相互作用而改變根的生長和形態。且植物生長調節劑的作用可能因HS刺激形態變化的方式而不同。

研究發現，類激素活性不僅與土壤HS有關，還與堆肥和原料有關。Scaglia等發現豬糞沼液中的DOM具有類生長素活性，這歸因于厭氧消化過程中產生的芳香族氨基酸，而未檢測到類赤霉素的活性。Scaglia等從原料和相應的蚯蚓糞中提取了類激素活性的物質（通過氣相色譜-質譜法鑒定）。羧酸和氨基酸被劃分為參與類吲哚乙酸活性的分子。

6 結論

在過去的40年里，許多實驗室和大田研究結果證明了HS及其組分對植物初生和次生代謝途徑的積極影響。HS對側根誘導和根毛生長的顯著影響可能是由于能量和氮途徑的變化及跨膜運輸引起的。不同分子量的HS可以被根吸收并轉運到植物的其他部位。HS通過與激素密切相關的機制影響植物的營養和發育。

HS的超分子結構，對理解其類激素活性非常重要。此外，HS相對于pH值的變化可能是控制生物分子有效性的關鍵。HS中與其生物活性直接相關的化合物種類的確定是進一步研究的重點。因此，HS的生物活性及其作用的分子機制將為農業可持續實踐提供新見解。

參考文獻（略）