腐植酸促進候選細菌豐富植物微生物群以抑制病原體

Maura Santos Reis de Andradeda Silva，Orlando Carlos Huertas Tavares，Thiago Gon?alves Ribeiro，Camilla Santos Reis de Andradeda Silva，Carolina Santos Reis de Andradeda Silva，3，José Maria García-Mina，Vera Lúcia Divan Baldani，Andrés Calderín García，Ricardo Luiz Louro Berbara，Ederson da Concei??o Jesus 著 李子東 熊傳教 周 欣 余玲玲 劉可星* 譯

1 巴西農業研究公司 巴西 23897-970

2 里約熱內盧聯邦農村大學 巴西 23890-000

3 弗洛米嫩塞聯邦大學 巴西 24210-240

4 西班牙納瓦拉大學 西班牙 31009

5 華南農業大學資源環境學院 廣州 510642

腐殖質（HS）通過影響土壤物理、化學和生物特性，進而對植物有益。HS還可以促進植物生長，包括改變根的厚度、長度、分枝和密度，從而改變根的結構（Canellas和Olivares，2014；García等，2016；Tavares等，2020）。但是，它的影響并不局限于根形態上的變化。腐植酸（HA）能調節激素信號通路，一些科學家認為腐殖質組分可以模擬生長素，被細胞受體識別（Canellas等，2002）。另有研究表明（Olaetxea等，2015），HA通過脫落酸（ABA）途徑調控脅迫條件下膜水通道蛋白（PIP）的基因表達。HA也可以調節植物的氧化還原代謝，調節活性氧的濃度，刺激過氧化物酶、過氧化氫酶和液泡膜水通道蛋白（TIPs）的表達（García等，2016）。

通過影響植物代謝，HS還可以改變根系分泌物的分布，從而干擾根際微生物群落結構（Puglisi等，2009，2013）。HS結構的復雜性使這些物質誘發多種代謝途徑，進而發生與植物相關的微生物相互作用。一些研究報道了外源施用HS和促生菌的益處（Canellas等，2013；Marques Júnior等，2008；Olivares等，2015）。例如施用HA后，血清草菌（Herbaspirillum seropedicae）在玉米根產生特異性的生物膜并定殖（Canellas和Olivares，2017），細菌和HA共接種保護植物免受水分脅迫的不利影響（Aguiar等，2016）。HA刺激氧化代謝酶（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶）活性，反過來，細菌誘導植物能保持相對含水量和氣孔（Aguiar等，2016）。

在文獻中已經證實，植物組織中自然維系著較高的微生物多樣性（Hardoim等，2008），這些內生微生物可以通過種子遺傳，正如在水稻的研究中已經證明的那樣。其中，與第一代種子相關的細菌群落，有45%已經在第二代中被發現（Hardoim等，2012）。這種微生物群落通過多種機制影響植物的生長、健康和生存（Ⅴandenkoornhuyse等，2015；Carrión等，2019），且與植物生理的變化密切相關（Hallmann和 Berg，2006），也與環境條件密切相關（Hardoim等，2012）。盡管HA很重要，但其對這些植物相關微生物群落影響的研究鮮有報道。如上所述，這些物質會影響植物的生理變化，我們有理由認為它們也會影響微生物群落。

在這種情況下，我們假設HA的作用與植物相關細菌群落的調節同時發生，特別是促進植物生長的細菌。為了驗證這一假設，我們將HS組分中可溶于堿性pH且在酸性介質中沉淀的HA（Schnitzer，1978），施用于水稻苗的根部，每隔72 h向營養液中添加HA，持續264 h。每間隔24 h采集植物1次，連續采樣，評估水稻發育情況。通過對240 h樣品的16S rRNA基因測序，對生長量變化和根系形態變化以及細菌群落的分類學特征進行評估。

1 材料和方法

1.1 HA的提取、純化和表征

從牛糞、蚯蚓糞中分離出HAs，并根據國際腐殖質學會（International Humic Substances Society，IHSS，2020）推薦的方法純化，詳情請參閱補充資料。HAs的理化性質見先前報道（Tavares等，2020）。

1.2 水稻植株根系形態參數的試驗設計、取樣及 評價

試驗采用完全隨機設計（Steel和 Torrie，1980）。處理包括：2個因素水平，HA施用（有或沒有HA）和采樣時間（試驗過程中每間隔24 h采樣1次，共采樣11次），共22個組合，每個組合6次重復，對528個試驗樣品進行評估。

“Piauí”水稻在光周期為12 h/12 h（光/暗）的條件下生長，光合作用的光子流為480 μmol/m2s，相對濕度為70%，溫度為28 ℃/24 ℃（晝/夜）。種子用2%次氯酸鈉消毒30 min，然后用蒸餾水洗滌10次。在萌發7天后，將秧苗移栽到有容量為0.7 L霍格蘭溶液的盆中（每盆4株）（Hoagland和 Arnon，1950）。

營養液中HAs施用劑量為80 mg /L，當養分濃度改變時，每72 h添加80 mg/L HA到營養液中，對照組不施用HAs。每24 h采集1次植株，直到移栽后264 h（共11天），并測定以下變量：根和地上部干物質量，葉面積，根系長度、表面積、體積以及根尖數量。用光電計（LI-3000，Li-Cor）測算葉面積。使用Epson Expression 10000XL系統掃描根部，該系統帶有一個額外的光單元（Turbo Pascal Unit，TPU）。參照前人的研究方法（Tavares等，2020），使用WinRhizo Arabidopsi軟件（Régent Instruments Inc.，Quebec，Canada）分析根長（mm）、表面積（mm2）、體積（mm3）和根尖數量。

數據正態性和同方差性分別用Shapiro-Wilk和Bartlett進行檢驗。參照Steel等（1980）使用的R軟件（R Core Team，2020），對數據進行方差分析（P〈0.05）。

1.3 水稻生長的定量分析

根據總干物質量和葉面積對植株生長進行分析。使用非線性回歸對原始數據進行調整，推導出生長率，并估算出瞬時速率值（Araújo和 Rossiello，2013）。因此，在Hunt（1982）提出的各種模型中，我們決定使用基于迭代過程的Logistic模型（Hunt，1982；Ritz等，2015）。模型的選擇是基于估計系數和決定系數（R2）的顯著性，以及被測變量的時間變化的整體趨勢（Araújo，2003；Araújo和 Rossiello，2013）。這是一個漸近模型，趨于最大值。由總干物質量或葉面積指數的Logistics函數[公式（1）]，得到絕對生長率[AGR，公式（2）]、相對生長率[RGR，公式（3）]和凈同化率[NAR，公式（4）]，計算公式如下：

其中，W為觀測數據，T為施用HA后的小時數，α，β，κ是非線性回歸系數。選擇Logistic模型是因為估計系數對觀測到的R2的顯著性（R2大于70%），以及所得曲線合適的生物學顯著性。AGR表示單位時間內生物量生產的速度，RGR表示單位已有材料的生物量生產的速度（Hunt，1982）。通過使用DRC軟件包的迭代過程，用數學函數處理葉面積和總干物質量的原始數據（Ritz等，2015）。

用F檢驗對數據進行方差分析。誤差的正態性通過Shapiro-Wilk檢驗和Bartlett檢驗來驗證差異的同方差性（Neter等，1974；Araujo，2003）。采用R軟件（R Core Team，2020）和ggplot2包（Wickham，2016），將數據呈現為具有F檢驗顯著性的箱形圖。

1.4 DNA提取和16S rRNA測序

第1次施用HA 240 h后，收集施用或未施用過HA的水稻植株，用于DNA提取和16S rRNA基因測序。根據PowerPlant ?Pro DNA分離試劑盒（MO BIO）的步驟，從地上部和根部提取總DNA。DNA質量檢測采用1%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠凝膠進行染色，并采用分光光度法在NanoDrop 1000中進行DNA定量。16S rRNA基因的Ⅴ4區測序采用515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACHⅤGGGTWTCTAAT）引物（Caporaso等，2012），并遵循地球微生物組項目的協議（http://www.earthmicrobiome.org/protocolsand-standards/16S/）。使用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）夾鉗，阻斷葉綠體和線粒體序列的擴增（Fitzpatrick等，2018）。在阿貢國家實驗室環境樣品制備和測序設備MiSeq測序機上進行測序。

1.5 序列分析

使用CASAⅤA v.1.8（Illumina）將基因文庫多路解編，將其存放在基因庫序列讀取檔案中，編號為SAMN5464651至SAMN5464666（補充表1）。序列分析使用了開源軟件Mothur v.1.41.1（Schloss等，2009），并按照MiSeq 標準操作程序指南進行（https://www.mothur.org/wiki/MiSeq_SOP）。正向序列和反向序列組裝，共產生288780個讀取量，范圍在247～502個堿基對之間，平均庫容量為16043個讀取量。去除不明確的序列，大于257 bp的序列，以及含有8個以上均聚物的序列。這些步驟之后，總共保留了245783個序列。將其劃分為29572個獨特序列，采用標準設置的全局比對方法（Needleman和 Wunsch，1970）與參考數據庫（SILⅤA bacterial release 132（Quast等，2012；Yilmaz等，2014） 的Ⅴ4區進行比對。對比序列使用pre.cluster（差異=2）程序進行分組，并使用UCHIME軟件檢查嵌合體（Edgar等，2011），然后將嵌合體移除。使用核糖體數據庫項目分類器工具（Cole等，2009）對操作分類單元（OTUs）分類，引導程序為80%。去除未知OTUs和真核生物、古生菌、線粒體、葉綠體。采用97%相似度（切值cutoff=0.03）的平均近鄰算法對序列進行聚類，使序列能在屬水平上進行分類（Comeau等，2011）。

將文件導入R軟件（R Core Team，2020），并使用軟件包phyloseq（McMurdie和 Holmes，2013）、stringr（Wickham，2016）、vegan（Oksanen等，2020）、DESeq2（Love等，2014）、factoextra（Kassambara和 Mundt，2020）、ggpubr（Kassambara，2020）和ggplot2（Wickham，2016）進行分析。首先，在OTU和門水平上，用OTU數據計算相關矩陣并進行主成分分析（PCA）（Legendre和 Legendre，1998）。在vegan軟件包中，這種排序方法是基于除趨勢對應分析（DCA）測量生態梯度的長度來選擇的（Ter Braak和 Prentice，1988），利用decorana函數對稀有物種減量進行計算。使用相關矩陣來避免非常豐富的OTU主導分析。采用k-means方法鑒定樣本組（Legendre和 Legendre，1998），通過999排列相似性分析（ANOSIM）評估各組的顯著性（P〈0.05）（Clarke，1993；Warton等，2012）。此外，將相同的數據通過Euclidean距離和Ward算法進行分層聚類分析，目的是進一步確認群落是如何根據其分類學組成進行分組的。

利用軟件包DESeq2的負二項分布差異基因表達分析（Love等，2014），鑒定了在HA處理植物中豐度差異富集或減少的細菌屬。DESeq2估算計數數據的方差-均值相關性，并基于使用負二項分布的模型測試其差異豐度。這種方法最初是為了識別RNA測序分析中的差異表達基因而開發的，同時也被用于識別宏基因組分析計數數據的差異。當顯著時調整的P值小于1%（P〈0.01），被認為是差異豐富的類群。箱形圖顯示了受顯著影響的類群的豐度。建立柱狀圖，用來顯示植物門和屬的豐度變化，未發現豐度〈2%的類群。

使用R軟件包SpiecEasi（Kurtz等，2021）、igraph（Csardi等，2006）和microeco（Liu等，2021）對每個處理進行網絡分析，OTUs之間的相關性由Sparcc算法推導（Friedman 和 Alm，2012）。通過100次重復計算相關顯著性，網絡中僅顯示大于0.6或小于-0.6（P〈0.01）的統計上顯著的相關性。使用Gephi軟件（Bastian等，2009）在Fruchterman-Reingold設計（Fruchterman等，1991）中繪制網絡圖，并在同一程序中計算其特性。

2 結果

2.1 HA對水稻干物質量、根系生長和發育的影響

HA對根和地上部干物質量累積的影響在整個評估階段有所不同。第1次施用HA 24 h后，根干物質量降低，48 h后恢復。在施用HA 144和216 h后，根干物質量增加（P〈0.001）（圖1a）。地上部干物質量也有類似的變化，在施用HA 144和264 h后顯著增加（P〈0.001）（圖1b）。

在整個試驗過程中觀察到干物質量累積的變化，NAR、AGR和RGR的結果顯示出HA對植物生長的正效應（圖1e、圖1c、圖1d）。在2個處理中，根據原始數據進行調整后的Logistic模型系數極其顯著（P〈0.001）（表1）。總干物質量的R2值在0.92～0.93之間，葉面積指數的R2值在0.90～0.92之間，始終較高，與原始數據吻合。NAR隨著HA的施用而增加（圖1e），表明HA對光合代謝成分有刺激作用。HA處理的結果表明，100 h時AGR和RGR增加，并一直保持到試驗結束（圖1c、圖1d）。

表1 用3參數對施用或不施用腐植酸處理的“Piaui”品種水稻植株總干物質量（TDW）和葉面積指數（LAI）進行Logistics回歸調整的決定系數（R2）、估計系數（α、β、κ）和概率（P值）Tab.1 Determination coefficient (R2 ), estimated coefficients (α, β, κ) and probabilities (p-value) of the logistic type regression adjustments with 3 parameters for total dry weight (TDW) and leaf area index (LAI) of the plants of rice var. Piaui treated with and without humic acid

施用HA顯著增加了根干物質量，根系長度、表面積和體積（圖1a和圖2a、圖2b、圖2c），這些響應隨測定時間不同而變化，但所有這些結果都指出了施用HA后水稻根系的形態變化和生長刺激。48 h后和整個試驗剩余時間里，根系體積顯著增加（圖2c），而在144 h后才觀察到HA對根干物質量的影響（圖1a），根系長度和表面積分別在216 h和192 h后顯著增加（圖2a，圖2b）。根尖數量除了第1次施用144 h出現了不利影響（P〈0.001）外，其余影響并不顯著（圖2d）。

2.2 HA作用下水稻植株共生細菌群落的變化

第1次施用HA 240 h后，收集施用和未施用HA的水稻植株，用于DNA提取和16S rRNA基因測序。利用PCA，將植物相關的細菌群落分為3大類：一是經過HA處理的根部細菌群落；二是沒有施用HA的根部細菌群落；三是在地上部形成的細菌群落（圖3）。這種劃分在OTU（圖3a）和門水平（圖3c）都可以觀察到，與PCA相似的DCA結果同樣支持這一劃分（補充圖1）。DCA的結果顯示，在根部細菌群落中，基于植物單元（根部與地上部）的細菌群落與經HA處理的群落之間存在區別，有更高的變異性，這與地上部相關的群落具有更高的多樣性和組成變異性是一致的（圖4）。這些結果得到了聚類分析（k-means或分層聚類）（圖3b、圖3c）和相似性分析（ANOSIM）的支持。ANOSIM分析表明，根部細菌群落與地上部細菌群落差異顯著（R=1，P=0.001），經HA處理的也類似（R=0.7526，P〈0.001）。雖然這些分析表明，施用與不施用HA的地上部相關群落之間沒有明顯不同，但在門和屬水平上，某些類群的豐度存在差異，這有待進一步討論。在地上部細菌群落的多樣性更豐富，從門和屬的數量較多這一點可以看出（圖4和補充圖2、圖3）。

圖1 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻的根（a）和地上部（b）干物質量以及絕對生長率（c）、相對生長率（d）和凈同化率（e）Fig.1 Root (a) and shoot (b) dry weight, absolute growth (c), and relative growth (d) rates and variations in the net assimilation (e) of rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖2 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻根系的長度（a）、表面積（b）、體積（c）和根尖數量（d）Fig.2 Root length (a), area (b), volume (c), and the number of tips (d) of rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖3 施用（HA）或不施用（C）80 mg/L腐植酸處理水稻根部植株間的細菌群落差異Fig.3 Bacterial communities differed between rice plants treated (HA) or not (C) with 80 mg/L of humic acids in their roots

圖4 根部和地上部中按門和屬分類的類群相對豐度Fig.4 Relative abundance of taxa in roots and shoot classified at phylum and genus levels

圖4 續

通過宏基因組分類方法，可以區分施用與不施用HA植物共生細菌群落的微生物類群，同時，可以區分這些微生物類群對植物生長的刺激。細菌群落的響應是：地上部變形菌門（Proteobacteria）豐度增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度減少（圖4a）。相反地，擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）在根部豐度增加。放線菌門（Actinobacteria）在兩個植株部位中豐度減少。根瘤菌屬（Rhizobium）是最豐富的屬（圖4b），主要存在于根部，它構成了50%以上的序列。與我們的預期相反，已被報道可促進植物生長的細菌，如賴氏菌屬（Leifsonia）、硝銨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和羅河桿菌屬（Rhodanobacter）的豐度在HA處理的根部減少（圖4a和圖5a、圖5b、圖5c）。相應地，擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度增加，尤其是粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）和噬幾丁質菌屬（Chitinophaga）（圖4和圖5d、圖5e、圖5f、圖5g），這種增加通過DESeq分析的統計結果得到驗證（補充表1）。假單胞菌（Pseudomonas）和 酸 桿 菌 門（Acidobacteria）的一組代表菌（Gp 1）也富集，但豐度較低（圖5h、圖5i）。雖然PCA分析結果沒有顯示出不同群落之間的明顯差異，但在某些屬的豐度上，仍然可以觀察到一些不同。例如，在HA處理的地上部，粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）、泛菌屬（Pantoea）、潘多拉菌屬（Pandoraea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和馬賽菌屬（Massilia）的豐度降低（圖5和補充圖4）。

圖5 在施用腐植酸（HA）的根中，其豐度不同程度減少（a、b和c）或富集（d至i）的主要類群Fig.5 Major taxa whose abundance were differently decreased (a, b, and c) or enriched (d through i) in roots that received humic acids (HA)

最后，用網絡分析來研究HA的施用如何影響細菌群落成員之間的相互作用。與對照植株相比，經HA處理植株的根部細菌網絡有更多的節點和連接，且正連接比例較大（圖6a，圖6b和表2）。該網絡模塊化更少，每個節點（平均度）的連接數量更大，路徑長度更短，表明群落成員之間的連接性更高（表2）。經DESeq分析鑒定不同豐度的一些屬，分別是粘液桿菌屬（Mucilaginibacter），新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium），Gp 1，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和一種未鑒定的鞘脂桿菌科Sphingobacteriaceae（補充表3），同樣屬于HA處理植株根部細菌網絡的10大中心類群。

與對照相比，HA處理的地上部細菌網絡節點和連接較少，負邊比例較大（圖6c、圖6d和表2）。盡管如此，前者顯示每個節點的連接數略多，路徑長度更短，表明群落成員之間的連接程度更高（表2）。

表2 施用與不施用腐植酸植株根部和地上部細菌的網絡屬性Tab.2 Attributes of bacterial networks in the roots and shoot of plants treated or not with humic acids

圖6 續

圖6 施用（a）和不施用（b）HA處理的植株根部，施用（c）和不施用（d）HA處理植株地上部的細菌網絡Fig.6 Bacterial networks in plant roots of HA-treated (a) and no HA-treated (b), and plant shoots of HA-treated (c) and no-HA-treated (d)

3 討論

在本研究中，我們評估了HA對水稻生長和根系形態的影響，并鑒定了在該條件下篩選出的細菌類群。結果表明，HA與植物相關的微生物群之間具有協同作用，它們都可以調節植物的生理過程，從而對植物有益（Canellas 和 Olivares，2014；Hallmann 和 Berg，2006）。HA的有益作用可能來自于其對植物代謝的直接作用，或通過對植物微生物群的刺激。根系體積受到顯著影響，其他幾個生長變量在植物生長周期的不同時間受到刺激。HA對植物生長的正影響主要表現為AGR、RGR和NAR的顯著提高（圖1c、圖1d、圖1e和表1）。NAR表示每單位總葉面積的干物質產生率，用于衡量植物的光合效率（Hunt，2017）；RGR是每單位現有干物質量累計新干物質量的速率，代表植物生產新干物質的效率（Lowry和 Smith，2018）；AGR表示干物質量隨時間的累積，本試驗AGR值越高表明植物生長過程中干物質量增加越快，在100 h后始終較高，直到試驗結束。

較高的生長率與較高的干物質量生產效率有關，說明光合效率和養分吸收提高，與我們的數據一致。其他研究報告認為HA可以促進光合作用（Jannin等，2012；Nardi等，2002），也有關于HS刺激植物主要代謝不同組分的影響報道，包括葉綠素a和b的活性（Yang等，2004）以及碳代謝不同組分的活性，主要是與酶刺激（Nardi等，2007），碳水化合物的產生（Merlo等，1991）和能量代謝基因的表達（Trevisan等，2011）有關。也有研究發現，施用HA可顯著提高油菜根系的液態光合速率、單個細胞葉綠體數量和淀粉粒數量，這些效應與C、N、S同化量的增加一致（Jannin等，2012）。這些研究者還記錄了HA誘導的根生長，在我們的工作中也觀察到了這一過程。應用時間評估方法，我們觀察到根和植物干物質量的增量隨觀測時間的變化而變化（圖1和圖2），以每天的取樣來評估這些參數的研究報道不多。然而，HA對根生長發育的刺激作用已有研究（Canellas等，2002；García等，2016；Mora等，2012；Zandonadi等，2010）報道過。

宏基因組分類分析表明，植物相關細菌群落對HA的施用有響應。水培條件下，2種處理的地上部細菌群落多樣性均高于根部。HA的施用導致了根部群落的顯著變化，而在地上部的影響較?。▓D3）。主要的變化是根部擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）的豐度增加，地上部變形菌門（Proteobacteria）的豐度增加而擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度減少。根瘤菌屬（Rhizobium）是豆科植物中最豐富的一個屬，特別是在根部。有研究報道了該屬存在于苜蓿（一種豆科植物）中，且不僅局限于根瘤，也可以在整個植株中發現（Sturz等，1997）。這些研究者還發現，葉部的細菌多樣性更高，與我們的觀察結果一致。該屬能夠在水稻上定殖（Hahn等，2016；Rosenblueth等，2018；Yanni等，1997），并被報道單獨接種或與巴西偶氮螺旋菌（Azospirillum brasilense）混合接種可促進水稻生長（Hahn等，2016）。

施用HA后，根部豐度最高的屬為噬幾丁質菌屬（Chitinophaga）和粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）（圖3c、圖4d、圖4e）。這2個屬都有產生一系列水解酶的成員，如葡聚糖酶和幾丁質酶，還有參與復合多糖的降解，例如真菌、卵菌和線蟲卵細胞壁中的多糖（Carrion等，2019；Ramamoorthy等，2001；Sharma等，2020；Yoon等，2012）。施用一種誘導植物系統抗病（Nicot等，2016）并與抑制病原體的植物（Dai等，2020）有關的化合物后，根際土壤中鑒定出這些相同的屬。此外，立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）對甜菜根的入侵，刺激了在抑病土壤種植植物中的噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae）成員富集（Carrion等，2019），這組成員對脫分支酶和與真菌細胞壁降解相關的酶庫有貢獻。結合其他機制（如鐵載體的產生），這些功能特征可以從內到外給植物提供保護。

假單胞菌屬（Pseudomonas）和放線菌Gp 1（Actinobacteria Gp 1）也在施用HA處理的根部被刺激，盡管它們的豐度比噬幾丁質菌屬（Chitinophaga）和粘液桿菌屬（Mucilaginibacte）的豐度低10～20倍。假單胞菌屬（Pseudomonas）被廣泛認為是一種促進植物生長的細菌，它通常與植物病原體的控制有關（Ramamoorthy等，2001）。除了誘導植物防御的直接作用外，來自該屬的細菌還能合成多種抗菌化合物和水解酶，能夠降解真菌細胞壁的成分（Ramamoorthy等，2001；Wang等，2019）。放線菌Gp1（Actinobacteria Gp1）被認為是通過idol-3-乙酸和鐵載體產生等機制促進植物生長（Kielak et等，2016）。我們強調的第二種機制也被報道為一種參與抑制植物病原體的機制（Kloepper等，1980）?？偠灾?，這些特性引起了人們對施用HA處理的植物中篩選出的細菌群落，可能在保護植物免受病原體侵襲方面的關注。

根部的細菌網絡在施用HA后，群落成員之間的連接性更高，這表現在它們的節點和連接數量增加（圖6和表2）。一些正向的和反向的關鍵類群被鑒定為屬于那些不同豐度的類群，如粘液桿菌屬（Mucilaginibacter）、鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）和放線菌Gp1（Actinobacteria Gp 1），進一步說明它們可能與施用HA處理的植株根部細菌群落有關，其中還包括被認為能夠產生II型多酮（Klein等，2020）的纖線桿菌屬（Ktedonobacter）和前面已討論的在所有處理和2個植物部位均發現的根瘤菌屬（Rhizobium）。

近年來的研究表明，抑病土壤根際群落是植物防御的第一道防線（Mendes等，2011），當這一屏障被打破時，病原體需要面對由植物誘導而產生的防御機制（Jones和Dangl，2006）。入侵和進入植物組織后，菌群的調節可以作為另一個保護層，為抵御感染進程的第三道防線（Carrion等，2019）。這方面的最新研究發現，在接種病原體的抑菌土壤種植的甜菜中，假單胞菌科（Pseudomonadaceae）和噬幾丁質菌科（Chitinophagaceae）均有富集，特別是第二家族的成員對脫支酶和真菌細胞壁降解的相關酶有貢獻。值得注意的是，在施用HA處理后，相似的菌群增加。

這是我們第1次注意到，HAs可能在刺激植物相關的細菌群落成員中發揮作用，從而保護植物免受病原體的侵襲。鑒于這些結果，我們認為植物組建這些微生物是為了應對HA-根相互作用引起的脅迫（Berbara和 García，2014；García等，2016）。當HA被施用于植物根部，HA組分在根表面凝聚，造成輕微和短暫的脅迫，在此基礎上，植物通過活性氧調節信號傳導，誘導植物進入保護非生物脅迫的生理狀態（Berbara和 García，2014；García等，2016）。這種脅迫可能是刺激植物群落組成變化和潛在參與植物防御的細菌富集的機制之一。此前的研究也表明，細菌和HA的共同應用提高了大豆植株對水分脅迫的恢復能力，進一步支持了我們的假設（Olivares等，2017）。這些類似研究的作者報告了在水分限制條件下，不同的甘蔗在使用細菌、HAs和兩者混合物時的反應，復水處理后，只有HA處理的植株超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等抗氧化酶活性仍較高。研究還指出了HS在植物對生物制劑抗性中的作用，以及對植物次生防御代謝的影響（Abdel-Monaim等，2011；Polak和Pospisil，1995）。HA處理的植株表現出較高的苯丙氨酸（酪氨酸）解氨酶（PAL/TAL；EC 4.3.1.5），它是1種催化酚類化合物生物合成第1步的酶（Canellas等，2013；Schiavon等，2010），是1種次生代謝產物，保護植物免受各種生物和非生物脅迫（Dixon和Paiva，1995）。有研究指出，HAs對苯丙素代謝的影響與它們的化學結構、共純化的真菌誘導子以及這些物質的其他信號分子有關（Schiavon等，2010）。

將植物暴露于HA引起的假脅迫，可以使植物更有效地耐受未來的脅迫條件，特別是生物脅迫。這種效應被稱為“啟動”效應，已經在先前施用過HA的玉米幼芽中觀察到（Canellas等，2020）。體外使用不同來源的HS，特別是堆肥中的HS，對真菌植物病原體具有抑制作用（Loffredo等，2008）。木霉（Trichoderma）是1種生物防治微生物，能夠抑制土傳植物病原真菌（Inbar等，1996）。相反，同樣的處理刺激木霉菌的生長。這些結果表明，植物代謝和有益微生物的共同作用具有抑制疾病的潛力，而施用HAs后，富集了這些微生物。

我們總結得出，HA的施用可以促進水稻根系生長發育，同時也改變了水稻細菌群落的組成。同時，我們還認為，HA可以激發微生物的富集，并有可能作用于植物的生長和植物對病原體的防御。這些結果在文獻中未見報道，并提出了先前開放式的問題，例如需要找到方法來闡明HA對植物生理和植物微生物群落參與的真正作用。我們的研究結果或許可以認為，使用HA作為策略的一部分，通過刺激植物的防御代謝包括組建抑制病原體的微生物來應對生物和非生物脅迫。

4 附錄A 補充數據

本文的補充數據可在此網頁查閱：https://doi.org/10.1016/j.apsoil.2021.104146。

致謝和參考文獻（略）