鐵皮石斛開放組培快繁研究*

王 娟，徐東亞，常 瑋

（河南南陽師范學院/生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473000）

石斛屬是蘭科最大屬之一，在全世界范圍內約有1 500種，且屬內多種植物具有不同程度的藥用價值和遺傳多樣性[1]。鐵皮石斛含有豐富的氨基酸、生物堿、多糖等活性成分，具有很好的降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等功效[2-3]。梁楚燕[4]等研究還證明鐵皮石斛鮮汁具有保肝護胃的作用。

目前，野生鐵皮石斛日漸稀少，生產上通常采用植物組織培養技術（Plant tissue culture）進行石斛種苗的快速繁殖。組培技術需要特定的設備及操作手段保證在整個培養過程中，培養物始終處于無菌的環境內。在培養過程中，主要通過高壓滅菌鍋、超凈工作臺等設備來確保無菌培養環境。然而這兩種設備的成本較高，限制了組培生產的規模。針對這一問題，一些研究者開展了大量的探索，提出了開放組培的概念。趙江雷[5]等在開放組培的基礎上，根據日本千葉大學古在豐樹教授的研究結果并結合自身研究成功實現了無糖組培技術；趙青華[6]等利用開放組培技術進行魔芋快繁技術研究；解輝[7]等將NaClO應用到香蕉開放式組織培養體系研究中，結果表明NaClO具有顯著地抑菌效果，可降低生產成本；崔剛[8]等探索了開放組培操作的工藝流程。

開放組培快繁技術是由實驗室組培向工廠化生產的必要步驟。本研究擬采用植物友好型抑菌劑植培靈和成本更低的塑料杯來進行鐵皮石斛的開放組培研究，通過對比開放組培技術及常規組培技術在污染率、增殖情況方面的差異，來研究開放組培的可行性，同時通過對二者前期投入及年累積成本的核算來比較二者的生產成本。對鐵皮石斛開放組培的相關研究，不僅可以促進鐵皮石斛的工廠化育苗，同時還能將其應用到其他種苗工廠化育苗當中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛無菌苗。

MS大量元素：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O。

MS微量元素：MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Cu-SO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、CoCl2·6H2O、H3BO3、KI。

FeSO4·7H2O、Na2-EDTA、肌酸、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、甘氨酸、NAA、6-BA、植培靈（上海涵宇生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

超凈臺（蘇凈安泰BCM -1000A）、高溫滅菌鍋（100 L/3.5 kW）、恒溫培養箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基制備比較

本研究所用基礎培養基為MS培養基，母液配制采用混配法，分別按照表1中所列試劑及其所需劑量進行大量元素、微量元素及有機物母液配制。

表1 MS培養基母液配制 mg/L

對于科學素養而言，其主要就是指人對于自然界的總體看法，主要包含科學觀、哲學觀念等，是人綜合素養中不可缺少的一項內容。而在初中階段的化學教學中，科學素養主要包含以下幾個方面：

DG-SHGR路由引用兩種轉發模式:直接轉發GSF(Go Straight Forwarding)[10]和空洞繞開轉發HBF(Hole Bypassing Forwarding)。當節點未遭遇路由空洞時,即正常情況,就利用地理位置路由的貪婪轉發模式傳輸數據包,將這種方式稱為GSF。這不是本文研究的重點。本文的研究重點是HBF。

以相同的工作效率進行常規組培時，一次性投入（10臺滅菌鍋+15個超凈臺）為：b常（萬元）=1.50（萬元/臺）× 10（臺）+0.12（萬元/個）× 15（個）=16.80（萬元）；年累計投入（200個工作日所需滅菌鍋和超凈臺電費）為：a常（萬元）=200（天）×（7.80 ×10-5（萬元/度）× 3.50（度/次）× 40（次）+7.80 × 10-5（萬元/度）×0.80（度/時）×120（時））=3.68（萬元）。

他剛到連隊感覺格外新鮮，住的是半挖半蓋的地窩子，吃的是大食堂，早上敲鐘上班，中午工地就餐，下午吹哨收工，完全是軍事化管理的模式。因剛從學校門出來，對于緊張的集體生活也能夠適應，只是每天勞動十幾個小時，加之勞動強度大有些吃不消，有過暗自流淚，也有過思想斗爭。那時的領導經常鼓勵他們，生活上問寒問暖，激勵他們克服困難，堅持鍛煉，就這樣，他順利地過了勞動關，完全適應了這個陌生的環境。

在常規組培中，每天可消毒288瓶（72瓶×4次，每瓶50 mL，可接種15株苗），按照每個工人平均每天接種200瓶計算，可供1.44人接種使用，即開放組培的1個生產單元為1.44人。

秸稈反應堆啟動后一個半月內的二氧化碳濃度明顯高于對照區，并且棚溫越高二氧化碳濃度差越明顯。之后影響逐漸下降，二個月后影響不明顯，詳見表1。

試驗所采用的培養基為鐵皮石斛不定芽誘導培養基（培養基A），主要成分為：MS+2.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂。在此基礎上開放培養所用的培養基（培養基B）額外添加了體積比為0.25%的植培靈。所有培養基的pH控制在5.6～5.8。

從現有的研究來看，有些研究只是單純注意到了這幾種句式的語體差異或只是關注了句式的表層意義，即使有學者將將句法和語義結合研究，但是對于現代漢語“讓”字句的分析仍不是十分完善和系統。”基于此，該文在加的夫語法的指導下，對現代漢語“讓”字引領的句法特征、語義特征和句法功能進行多維角度的論述，以期為漢語學界對有關“讓”字的研究提供一個新的研究視角和研究思路。

在開放組培中，每天可消毒6 000杯（2 000杯×3次，每杯30 mL，可接種7～8株苗），按照每個工人平均每天接種400杯計算，可供15人接種使用，即開放組培的1個生產單元為15.00人。

1.3.2 接種環節比較

如果企業是侵權人的，企業應在接到權利人通知后及時核實是否侵權，并通過以下幾方面尋找合理的抗辯事由：如不侵權抗辯，即被控侵權產品未落入專利的保護范圍；二是自由公知技術抗辯，被控侵權產品使用了專利申請日前的技術；三是專利權無效抗辯，通過無效對方的專利權來達到不侵權的目的；四是先用權抗辯，主張在專利申請日前已經使用的；五是合法來源抗辯，僅適用于銷售者；六是法定不侵權抗辯。

Thanksgiving Day is a time to offer thanks, please express your gratitude and blessings to your family and friends with the help of the following expressions on this special day!

1.3.3 生產成本比較

為了更好地將開放組培技術應用到實際生產中，本研究擬通過對比開放組培及常規組培的生產成本來更合理地指導生產。對比方法如下：首先按照1臺100 L滅菌鍋對組培杯進行滅菌的效率計算為標準，分別計算開放組培時所需簡易臺數目，以及常規組培時所需超凈臺數目以及所需配套的滅菌鍋數目。再根據前期的設備投入計算一次性投入（b）；根據電費、抑菌劑費用計算相應的年累積投入（a），最終以年為自變量，分別計算并比較隨時間增加2種方法的總成本投入情況。

1.4 數據分析

污染情況以污染率表示：污染率=污染瓶（杯）數/接種瓶（杯）數；增殖情況以增殖系數表示：增殖系數=再生不定芽數/接種外植體數。數據統計、描述統計、方差分析及相關圖表用PASW Statistics（formerly SPSS Statistics）軟件進行分析和制作。

2 實驗結果

2.1 污染率比較

在培養基制備10 d后，以未經滅菌的培養基A為對照，分別統計經高溫高壓滅菌的培養基A和未經滅菌的培養基B的污染率，以此對高溫高壓滅菌效果和抑菌劑的抑菌效果進行比較。結果如圖1所示，未經滅菌的培養基A污染率為100%；經高溫高壓滅菌的培養基A污染率為2.41%；未經滅菌的培養基B污染率為0.33%。

2.2 接種過程比較

接種過程比較分別從接種過程和培養過程進行比較。在培養基接種40 d后，以高溫高壓滅菌培養基A在開放環境下接種為對照，分別統計經高溫高壓滅菌的培養基A在無菌環境和未經滅菌的培養基B在開放環境的污染率，以此對高溫高壓滅菌效果和抑菌劑的抑菌效果進行比較。結果如圖2所示，經高溫高壓在開放培養下的污染率為15%；經高溫高壓滅菌的培養基A在無菌環境下污染率為5%；未經滅菌的培養基B的污染率為0。

培養60 d后，選擇未污染組培苗進行增殖率比較。經方差分析顯示，開放組培和常規組培在接種苗增殖上差異不顯著（p=0.604 7）。進一步證明了開放組培的可行性。

鐵鹽溶液中先稱量FeSO4·7H2O 以及Na2-EDTA，分別用450 mL的蒸餾水進行溶解，分別加熱，并不停攪拌至完全融化，再把FeSO4·7H2O溶液緩緩倒入Na2-EDTA溶液中，將2種溶液混合均勻后倒入容量瓶定容后倒入棕色試劑瓶中，并放置于冰箱中保存。

2.3 成本比較

2.3.1 組培生產單元計算

本研究將1臺滅菌鍋在1個工作日（8 h）內能滿足的最大生產人數作為1個生產單元，即1臺滅菌鍋1 d內生產的培養基至少可供接種的人數。以1臺100 L高壓滅菌鍋為例：

上述2種培養基經加熱煮沸后分別進行分裝，培養基A分裝于220 mL透氣組培瓶，培養基B分裝于經高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）的塑料杯中，并用滅菌透氣封口膜封口。分裝過程均在開放環境下進行（分裝前15 min，用75%乙醇進行室內降塵）。分裝結束后培養基A經高壓蒸汽滅菌，培養基B不進行滅菌，待培養基A滅菌結束后，放置于室溫環境下，10 d后觀察各處理培養基污染情況，每個處理3次重復。

6-BA母液的濃度為1 mg/mL，配制時先用少量1 mol/L的HCl將100 mg 6-BA進行溶解，再溶于90 mL蒸餾水中，最后用蒸餾水定容100 mL，貯藏于棕色試劑瓶中，貼好標簽放入冰箱內低溫保存。

因此，為達到與開放組培1個生產單元同樣的生產效率，至少需要約10個常規組培生產單元。

2.3.2 投入成本計算

為比較常規組培與開放組培的應用效果，將上述2種培養基分別在超凈臺內及開放環境下進行接種，接種方法如下：（1）超凈臺內接種：在超凈臺內分別將石斛接種到培養基A、B中，接種方法按常規無菌操作流程進行，主要步驟如下：接種前先在超凈工作臺內噴75%乙醇，并打開紫外燈消毒20 min后打開風機，正式接種前再用75%酒精仔細擦一遍臺面，消毒結束后按無菌操作步驟進行接種操作，每種培養基分別接種10瓶（杯），接種后放于光照培養箱內培養（環境溫度：25 ℃；濕度60%；光周期：12 h/12 h）。分別于接種40 d和60 d統計鐵皮石斛組培苗的污染情況及增殖情況。（2）開放環境接種：在簡易工作臺內分別將石斛接種到培養基A、B中，除沒有風機外，其余步驟與在超凈臺內接種相同。每種培養基分別接種10瓶（杯），接種后放于光照培養箱內培養（環境溫度：25 ℃；濕度60%；光周期：12 h/12 h）。分別于接種40 d和60 d統計鐵皮石斛組培苗的污染情況及增殖情況。

以開放組培1個生產單元的生產效率為標準，在進行開放組培時，一次性投入（1臺滅菌鍋+15個簡易臺）為：b開（萬元）=1.50（萬元/臺）× 1（臺）+0.02（萬元/個）×15（個）=1.80（萬元）；年累計投入（200個工作日所需滅菌鍋電費+抑菌劑費用）為：a開（萬元）=200（天）×（7.80×10-5（萬元/度）×3.50（度/次）×3（次）+6.50×10-3（萬元/瓶）×4.50（瓶））=6.01（萬元）。

NAA母液的濃度為1 mg/mL，配制時先用少量95%的乙醇將100 mg NAA進行溶解，再溶于90 mL蒸餾水中，最后用蒸餾水定容100 mL，貯藏于棕色試劑瓶中，貼好標簽放入冰箱內低溫保存。

2.3.3 生產成本計算

現如今，隨著我國經濟發展速度的不斷加快，城市化進程速度也在不斷提升，道路橋梁建設項目也越來越多，人們對市政道路橋梁的建設質量也越來越高度關注。因為市政道路橋梁工程的建設質量直接關系到城市的經濟發展以及人們的通行順暢安全，而道路橋梁工程的伸縮縫是質量管理中最重要的內容之一，因此進一步加強對其的研究非常有必要。在實際應用中工作人員需要做好準備工作，同時采取有效的措施進行優化，并嚴格的控制每一個環節，從而能夠更好的確保道路橋梁工程建設質量。基于此本文分析了市政道路橋梁伸縮縫施工質量技術控制。

以年為自變量（X），以一次性投入（b）和年累計投入（a）為參數，如圖3所示，生產成本可以表示為一條隨著時間增加而持續增長的直線。根據前面的研究結果，開放組培的成本可表示為：y開（萬元）=a開× x+b開=6.01x+1.80（x ≥0）；常規組培的成本可表示為：y常（萬元）=a常× x+b常=3.68x+16.80（x ≥0）。根據二者直線方程可知，在定義域內，二直線相交，經計算，其交點為（6.44，40.50），即當生產時間增加至6.44年的時候，二者生產成本相等，為40.50萬元。

3 討論

3.1 生產效果比較

在本研究中，開放組培培養基的污染率為0.33%，常規組培的培養基污染率為2.41%。開放組培接種過程污染率為0%；常規組培接種過程污染率為5%。對比二者增殖情況，開放組培和常規組培中不定芽的增殖率差異不顯著。崔剛[9]等進行葡萄開放式組織培養研究以及徐曉敏[10]薯類作物開放式組培研究等都證明了這一點。可見，通過開放組培的方式進行鐵皮石斛種苗的培育是可行的。

由圖3可知，由于示例飛機最大飛行高度較低，其駕駛艙和客艙壓差峰值較8000ft高度下主風擋破裂小。在決定是否在駕駛艙門上設置泄壓板時，可選取兩者中較嚴酷的壓差峰值，與駕駛艙門結構承載能力進行比較。當壓差峰值超過駕駛艙門結構壓差承載限值時，則需在駕駛艙門上加裝泄壓板。

3.2 生產成本比較

由結果可知，常規組培前期的成本投入非常高，主要是儀器費用以及電費這兩個方面。開放組培在前期投入就遠遠少于常規組培。張艷[11]在杉木開放式組織培養的初步研究中也證實了這一情況。在相同生產效率下，且不考慮設備維修及報廢的前提下，開放組培在6.44年后的生產累計成本才高于常規組培。如果當電力成本減小那么這個時間將往前移。同樣，當植培靈成本降低或者換用其他價格較低的抑菌劑能達到同樣效果時，那么這個時間會推遲。

例2：“Z文件中的24小時降水量與實際統計計算值不相等”。該疑誤信息出現的原因有以下幾種：(1)臺站作維護時，發現有滯后降水、昆蟲致其空翻等原因造成的虛假降水并將其刪除，但未及時發更正報，導致省局接收的對應時次Z文件中小時降水量有誤；(2)臺站作維護時，發現有滯后降水、昆蟲致其空翻等原因導致的虛假降水并將其刪除，同時發送了更正報，但由于發現虛假降水的時間較晚，導致后續時次Z文件中累計降水量有誤(3)其他未知原因。

3.3 開放組培優點

由于開放組培最初成本投入比較小，因此有利于企業成立初期資金較為短缺的情況下進行大規模生產，不僅可以解決資金短缺的問題，還能降低運營風險，使組培育苗成為低投入、高產出、低風險的生產方式。

除上述優點之外，在進行鐵皮石斛開放組培的同時，還采用相同的技術進行雜交構樹組培苗的培育工作。在培養過程中發現：采用開放組培時，由于“塑料杯+封口膜”的培養容器透氣性較好，與玻璃組培瓶相比玻璃化現象大大降低，極大提高了組培苗的成活幾率。張敏[12]等對影響草莓玻璃化若干因素的研究也表明：增加封口膜的透氣性可大大減少玻璃化現象的產生。同時塑料杯由于質量輕，轉運方便，更適合組培苗煉苗及轉運，可大幅提高轉運效率，降低人工成本。

4 結論

本研究結果表明，開放組培培養基無需高壓滅菌，接種只需在自然、開放的環境中進行，不用超凈工作臺，可從根本上簡化組織培養環節，降低組培成本；開放組培與常規組培相比污染率和增殖效果差異不明顯。同時，生產成本比較結果表明，在相同生產規模下，一定時間內（6.44年）開放組培的生產投入低于常規組培。開放組培與傳統組培對比，不僅可以降低成本，而且操作簡單，只要按不同的培養基配方配制后，再加上抑菌劑即可。投資少，實用性強，推廣性好，可將開放組培技術應用到鐵皮石斛的種苗生產中。