冷藏小龍蝦優勢腐敗菌的篩選鑒定及細菌群落結構和多樣性分析

孟凌云 戴澤川 李嬌 毛相朝

摘 要：以4 ℃貯藏小龍蝦貨架期終點篩選武漢孝感小龍蝦中優勢腐敗菌，同時結合高通量測序方法，進一步確定小龍蝦中優勢腐敗菌，并對小龍蝦貯藏過程中菌相變化、微生物結構及其多樣性進行分析。結果表明：傳統培養法從腐敗小龍蝦中共篩選出10 株腐敗菌，包括波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）等;在屬水平上，高通量測序法最終確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）

及希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）是小龍蝦腐敗末期相對豐度最大的2 種優勢腐敗菌;同時，高通量測序結果表明，隨著貯藏時間的延長，小龍蝦微生物群落豐富度、多樣性及均勻度不斷下降，這與腐敗末期優勢腐敗菌的大量增長及生長繁殖過程中抑制其他種類微生物有關。

關鍵詞：冷藏小龍蝦;優勢腐敗菌;傳統培養基法;高通量測序;微生物多樣性

Screening and Identification of Dominant Spoilage Organisms and Analysis of Bacterial Community Structure and Diversity in Refrigerated Crayfish

MENG Lingyun1， DAI Zechuan1， LI Jiao1，*， MAO Xiangzhao1，2

（1.College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266003， China; 2.Qingdao National Pilot Laboratory for Marine Science and Technology/Laboratory for Marine Drugs and Biologiacal Products， Qingdao 266237， China）

Abstract： At the end of the shelf life of crayfish stored at 4 ℃， the dominant spoilage organisms in crayfish from Xiaogan， Wuhan were isolated and identified by high-throughput sequencing， and the changes in the bacterial community structure and diversity in crayfish during storage were analyzed. The results showed that 10 spoilage bacterial strains were obtained by the traditional culture-dependent method， including Shewanella baltica， Aeromonas veronii and Proteus vulgaris， etc. Aeromonas sp.

and Shewanella sp. were confirmed as the dominant spoilage organisms， with the largest relative abundance at the end of crayfish spoilage. At the same time， the results of high-throughput sequencing showed that the abundance， diversity and evenness of the microbial community decreased with storage time， which was related to the rapid growth of the dominant spoilage organisms and the inhibition of other kinds of microorganisms at the end of the spoilage stage.

Keywords： refrigerated crayfish; dominant spoilage organism; traditional culture-dependent method; high-throughput sequencing; microbial diversity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050

中圖分類號：TS254.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2022）06-0016-07

引文格式：

孟凌云， 戴澤川， 李嬌， 等. 冷藏小龍蝦優勢腐敗菌的篩選鑒定及細菌群落結構和多樣性分析[J]. 肉類研究， 2022， 36（6）： 16-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050.? ? http：//www.rlyj.net.cn

MENG Lingyun， DAI Zechuan， LI Jiao， et al. Screening and identification of dominant spoilage organisms and analysis of bacterial community structure and diversity in refrigerated crayfish[J]. Meat Research， 2022， 36（6）： 16-22. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220505-050.? ? http：//www.rlyj.net.cnFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

小龍蝦，也稱克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬于淡水經濟蝦類，原產于北美洲地區，19世紀30年代引入我國[1-2]。因其風味獨特、肉質鮮美，同時具有高蛋白、低熱量的特性[3]，受到廣大消費者的喜愛，成為人們餐桌上常見的美食。水產品由于營養豐富且水分含量較高而容易引起細菌的增殖進而腐敗，難以保存[4-6]。而小龍蝦好溫喜濕，常見于淤泥等復雜生長環境，因此其本身攜帶的微生物種類和數量更多。同時，小龍蝦含有大量的自由氨基酸及內源氧化酶，因此相較于其他水產品而言，更容易遭到微生物的侵襲[7-8]，這些都在一定程度上影響了小龍蝦產業的發展。

大量研究發現，在水產品腐敗過程中部分種類細菌的數量逐漸上升并占據絕對優勢地位，對水產品的腐敗變質起著主導作用，這些細菌被稱為優勢腐敗菌[9]，其為水產品品質下降最重要的原因。不同水產品的優勢腐敗菌種類會存在一些差異，于淑池等[10]發現，冷藏卵形鯧鲹中優勢腐敗菌為希瓦氏菌及假單胞菌，Leroi等[11]在4 ℃冷藏生鮭魚中發現其優勢腐敗菌主要為假單胞菌，南美白對蝦中主要腐敗菌則為不動桿菌、希瓦氏菌[12]，而淡水水產品，如鰱魚和草魚中的優勢腐敗菌主要為氣單胞菌[13]和假單胞菌[14]。對于水產品中優勢腐敗菌的篩選和鑒定，在早期的研究中一般都是利用傳統培養法

進行[15-16]。隨著分子生物學的進步與發展，目前研究中廣泛利用傳統培養法結合高通量測序法對優勢腐敗菌進行篩選和鑒定。同時，高通量測序方法還可以對貯藏過程中水產品的微生物結構組成及其多樣性進行分析，目前已在帶魚[17]、牡蠣[18]等水產品中成功應用，明確了微生物在產品貯藏過程中的變化趨勢。

本研究篩選和鑒定武漢孝感小龍蝦4 ℃貯藏過程中的優勢腐敗菌，并對小龍蝦貯藏過程中菌相變化以及微生物菌群結構及其多樣性進行分析。優勢腐敗菌是水產品品質的關鍵控制點，與水產品貨架期密切相關，因此開展對小龍蝦中優勢腐敗菌的研究與篩選鑒定，有利于下一步利用殺菌保鮮技術靶向殺滅優勢腐敗菌，提高保鮮效果，延長小龍蝦貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦來源于武漢孝感，經加冰保活運送至實驗室備用，進行實驗操作前加冰猝死。

氯化鈉、硼酸、氧化鎂、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司;營養瓊脂（nutrient agar，NA）、假單胞菌選擇性瓊脂（Pseudomonas CFC selective agar，CFC）培養基、三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）培養基、BP（Baird-Parker）培養基、氣單胞菌基礎（Aeromonas medium base，RYAN）培養基 青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

K9840自動凱氏定氮儀 海能儀器有限公司;JY2002電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;

TS-2402CL恒溫振蕩器 上海天呈實驗儀器制造有限

公司;GXM-358恒溫培養箱 寧波江南儀器制造廠;GI80TW全自動高壓滅菌器 南京庚辰儀器科學有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小龍蝦貯藏期間菌落總數的測定

采用活菌平板計數法，測定小龍蝦中總需氧菌菌落總數，測定方法參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。稱取10 g蝦肉，加入90 mL無菌生理鹽水，在無菌條件下勻漿，制成10 g/100 mL樣品均質液。之后用生理鹽水進行10 倍梯度稀釋。取稀釋后的樣品100 μL涂布于NA平板上，于30 ℃恒溫培養箱中培養36～48 h，選取合適的平板進行菌落計數，單位為lg（CFU/g）。

1.3.2 小龍蝦貯藏期間總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的測定

每隔2 d測定小龍蝦中TVB-N含量，測定方法參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》中的方法二自動凱氏定氮儀法。準確稱取2 g蝦肉糜于蒸餾管中，之后加入75 mL純水，振蕩使樣品均勻分散，并在水中浸漬30 min。測定前加入1 g MgO，將蒸餾管連接至自動凱氏定氮儀。以20 g/L硼酸為接收液，0.01 mol/L鹽酸為滴定液，1 g/L甲基紅-乙醇溶液和1 g/L溴甲酚綠-乙醇溶液以體積比1∶5混合作為混合指示劑。

1.3.3 腐敗菌單菌落的分離及純化

將鮮活小龍蝦碎冰猝死后，置于4 ℃條件下貯藏，選擇貯藏腐敗終點的小龍蝦樣品按照1.3.1節中的方法制成菌懸液，進行10 倍梯度稀釋，選擇合適稀釋倍數菌液均勻涂布于NA、CFC培養基、TSI培養基、BP培養基、RYAN培養基，置于30 ℃恒溫培養箱中孵育48 h，在選擇性培養基上挑選不同顏色、形態的菌落，挑取單菌落并進行2～3 次劃線純化，并于-80 ℃保存。

1.3.4 腐敗菌菌種的鑒定

1.3.4.1 分子生物學鑒定及系統發育樹的構建

腐敗菌接種于營養肉湯培養基中孵育至對數穩定期，提取細菌DNA并進行16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，最終產物送往北京擎科生物科技有限公司進行測序。將測序結果在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）與Gen Bank庫中進行BLAST序列比對。選取相似性在98%以上的菌株序列，利用MEGA 7.0.26軟件中的鄰近法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹。

1.3.4.2 生理生化實驗鑒定FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》等，應用一系列生理生化實驗，將篩選得到的腐敗菌菌種作進一步鑒定。

1.3.5 高通量測序法測定小龍蝦中優勢腐敗菌

選取在4 ℃貯藏0 d（鮮樣期）、8 d（腐敗初期）、12 d（腐敗中期）、16 d（腐敗末期）的小龍蝦，取蝦肉進行制樣，得到菌懸液。提取樣品菌懸液的DNA，并進行PCR擴增，將檢測合格后的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司進行高通量測序。

1.4 數據處理

每組實驗設置3 次平行，結果用平均值±標準差表示。利用SPSS 17.0軟件對數據進行差異顯著性分析，差異顯著性標準為P<0.05，采用Origin 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小龍蝦4 ℃貯藏期間菌落總數及TVB-N含量變化

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

水產品及肉類食物容易在微生物及酶的作用下發生蛋白質分解、脂質氧化等生化反應，進而引起腐敗變質[19]。

因此可以通過測定小龍蝦肉中的菌落總數來初步判斷小龍蝦被細菌污染及腐敗的程度[20]，反映蝦的品質[21-22]。

由圖1可知，小龍蝦在4 ℃貯藏過程中的菌落總數隨著時間的延長呈現上升的趨勢，貯藏0～2 d，其增長趨勢比較緩慢，說明小龍蝦并沒有發生明顯的腐敗。而貯藏2～10 d，菌落總數急劇增加，說明小龍蝦在這個過程中發生嚴重腐敗。貯藏6 d左右，小龍蝦菌落總數超過無公害水產品安全限值（6.0（lg（CFU/g））），表明此時小龍蝦腐敗嚴重，到達了其貨架期的終點。江楊陽等[23]

對江蘇盱眙產地小龍蝦研究發現，菌落總數也在6 d超過

6.0（lg（CFU/g））。除此之外，Li Yan等[24]發現，南美白對蝦同樣在貯藏6 d菌落總數超過了限值。本實驗中的小龍蝦在貯藏10 d之后，菌落總數不再明顯增長，逐漸進入穩定期。

TVB-N是在微生物和酶的雙重作用下分解蛋白質等含氮物質產生的生物胺、氨等揮發性堿性代謝物質的總稱[25]，其含量是評價水產品及肉類品質最重要的指標，是判斷水產品新鮮程度及是否腐敗變質的重要因素[26]。由圖2可知，在整個貯藏過程中，TVB-N含量整體呈現上升趨勢，前期增長比較緩慢，在貯藏后期隨著菌落總數的快速增長、腐敗加劇，導致了TVB-N含量增加速率加快[27]。

小龍蝦TVB-N含量在貯藏6 d時已達43.28 mg/100 g，與秦求思等[28]測得的4 ℃貯藏6 d的鷹爪蝦TVB-N含量相近，超過GB 10136—2015《食品安全國家標準 動物性水產制品》中所規定的淡水水產品TVB-N含量限定值30 mg/100 g，并且伴隨強烈的動物腐爛的氨臭味。這與小龍蝦菌落總數超過限值的貯藏時間相一致，表明TVB-N含量變化與菌落總數密切相關，結合2 個指標結果綜合分析得出，小龍蝦在貯藏6 d時已經腐敗。

2.2 優勢腐敗菌單菌落的分離

選擇在4 ℃貯藏至腐敗的小龍蝦進行平板涂布、劃線，根據菌落形態及顏色差異在5 種固體培養基上分離純化出10 株細菌，編號依次為B1～B10。10 株細菌菌落形態及顏色具體見表1。

2.3 腐敗菌菌種的鑒定

2.3.1 腐敗菌菌株分子生物學鑒定

對菌株B1～B10進行16S rDNA測序后，登錄NCBI網站進行BLAST序列比對，并選取Max ident在98%以上的菌株，構建系統發育樹，根據系統發育樹（圖3）及測序對比結果，將B5、B6、B7、B9及B10細菌定種，分別為中間氣單胞菌（Aeromonas media）、巨型球菌（Macrococcus caseolyticus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）及缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。

2.3.2 生理生化實驗鑒定

根據測序結果及系統發育樹已對部分菌株定種，對仍無法定種的幾種腐敗菌進行生理生化實驗，結果如表2所示，最終確定菌株B1～B4及B8的種類，分別為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）、弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）和嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）。

2.4 4 ℃貯藏小龍蝦高通量測序結果分析

2.4.1 小龍蝦4 ℃貯藏期間微生物群落的α-多樣性

α-多樣性分析可以反映小龍蝦樣品中微生物的多樣性（豐富度及均勻度），由多種指數進行評價，主要包括反映微生物群落豐富度的Ace指數、Chao 1指數和Richness指數，可以體現微生物群落多樣性的Shannon指數和Simpson指數，以及覆蓋率[29]。

由表3可知，Ace指數、Chao 1指數及Richness指數隨著貯藏時間的延長逐漸減小，這說明小龍蝦樣品在貯藏過程中微生物群落豐富度不斷降低，微生物群落中物種種類逐漸減少，出現了優勢菌屬。而代表樣品中微生物群落多樣性的Shannon指數和Simpson指數也均降低，表示貯藏過程中小龍蝦樣品的微生物多樣性也在逐步降低[30]，物種均勻度下降。說明在小龍蝦貯藏后期，出現了在數量上占絕對優勢的細菌，并且這些細菌可能抑制了其他種類細菌的生長，從而降低了微生物群落的多樣性。

稀釋曲線體現對小龍蝦樣本的取樣深度，可以用來評估測序量的合理性[31]。由圖4A可知，隨著測序深度的增加，小龍蝦稀釋曲線逐漸平緩，說明測序量足夠且充分，測序樣本能夠合理反映樣品中物種信息。由圖4B可知，Shannon指數曲線也逐漸趨向平緩，代表微生物多樣性不會再增加。同時表3中覆蓋率均大于99%，因此，上述數據可以證明小龍蝦樣本的高通量測序數量合理，且能夠正確反映出小龍蝦樣品中微生物的多樣性及豐富度。FE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE

2.4.2 小龍蝦4 ℃貯藏期間細菌群落的β-多樣性

對4 ℃貯藏小龍蝦細菌群落進行基于操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）的主成分分析（principal component analysis，PCA），PCA是通過降維處理展現樣本特定距離的分布方法，PCA圖中不同樣品間距離的遠近可以反映不同樣本相似性的大小[32-33]。由圖5可知，PC1、PC2的解釋度分別為68.08%和20.03%。從樣品分布可以看出，貯藏0 d樣本與貯藏16 d的樣本距離最遠，說明其菌群組成差異最大。相對而言，貯藏8、12、16 d的樣本則較為聚集，表示雖然這些樣本之間存在一定的差異，但其菌群結構還是具有較高的相似度，而貯藏12 d與16 d樣本距離最小，說明二者菌群結構相似度最高。小龍蝦細菌菌群β-多樣性的分析結果顯示，小龍蝦中微生物結構在貯藏過程中不斷發生變化，最終造成鮮樣期小龍蝦與腐敗末期小龍蝦微生物結構之間產生較大的差異。

2.5 小龍蝦貯藏期間微生物物種組成及聚類分析

對測序得到的序列進行聚類分析，以98%以上的序列聚類成OTU，并根據不同貯藏時間小龍蝦樣本所對應的OTU繪制維恩圖。由圖6可知，貯藏0、8、12、16 d樣品含有的OTU數分別為2 830、1 379、1 121和977。貯藏12 d（腐敗中期）與16 d（腐敗末期）樣品中相同的OTU數為674，高出貯藏0 d（鮮樣期）與16 d（腐敗末期）樣品約500，因此可以說明腐敗中期與腐敗末期的小龍蝦樣品微生物物種相似度更高。

由圖7可知，從整體上看，小龍蝦樣品中物種組成差異較大。總共涉及到17 個菌屬，包括氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）、黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）、變形桿菌屬（Proteus sp.）、

不動桿菌屬（Acinetobactor sp.）、叢毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、漫游球菌屬（Vagococcus sp.）等，高通量測序法除傳統培養法篩選到的10 株細菌外還鑒定出黃桿菌屬、叢毛單胞菌屬和漫游球菌屬等7 個菌屬，體現了高通量測序法的準確性及全面性。隨著貯藏時間的延長，小龍蝦鮮樣期相對豐度較大的細菌，如叢毛單胞菌屬、漫游球菌屬逐漸減少，而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度則逐漸增加并成為優勢菌群。在鮮樣期（0 d），氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度分別為1.40%、0.82%。而隨著貯藏時間的延長，其相對豐度迅速增大，在貯藏末期（16 d），2 種細菌的相對豐度分別達到38.7%、18.9%。結合傳統培養法在小龍蝦中篩菌結果可知，本實驗中小龍蝦樣品的優勢腐敗菌為氣單胞菌及希瓦氏菌。黃佳奇[34]發現，冷藏小黃魚的優勢腐敗菌為變形桿菌及希瓦氏菌，而朱素芹等[35]在凡納濱對蝦中篩選得到的優勢腐敗菌則為希瓦氏菌及不動桿菌，與本研究中產自武漢孝感的4 ℃貯藏小龍蝦中篩選分離得到的優勢腐敗菌為希瓦氏菌及氣單胞菌有所差異，可能是由于不同品種的水產品優勢腐敗菌有所差異。而本研究優勢腐敗菌種類與先前研究得出的小龍蝦中優勢腐敗菌為希瓦氏菌、肉食桿菌[23]、陰溝腸桿菌[36]的結論也稍有不同，這說明即使是同一種水產品，其優勢腐敗菌也會因產地和貯藏溫度的影響而發生變化。

3 結 論

本研究對產地為武漢孝感的冷藏小龍蝦中優勢腐敗菌進行篩選鑒定，并對小龍蝦貯藏過程中微生物結構變化及多樣性進行分析。傳統培養法從冷藏小龍蝦中共篩選出維氏氣單胞菌、波羅的海希瓦氏菌、普通變形桿菌等10 株細菌，結合高通量測序結果，最終確定小龍蝦中主要優勢腐敗菌為氣單胞菌屬和希瓦氏菌屬。同時，高通量測序結果表明，小龍蝦在貯藏過程中微生物結構一直在變化。某些細菌數量逐漸減少，如在鮮樣期（0 d）小龍蝦中相對豐度較大的細菌叢毛單胞菌屬在腐敗末期小龍蝦中相對豐度小于1%。而氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬相對豐度在貯藏過程中一直增大，并最終占據腐敗小龍蝦中微生物的主導地位。在腐敗末期，氣單胞菌屬、希瓦氏菌屬、變形桿菌屬、不動桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、巨球菌屬6 種菌屬的總相對含量為85%以上。α-多樣性分析表明，小龍蝦鮮樣期OTU數量最多，菌群群落結構豐富度、多樣性及均勻度最高。而隨著貯藏時間的增長，多樣性、豐富度及均勻度都在下降，尤其是在腐敗末期到達最低，這可能與優勢腐敗菌的大量繁殖及繁殖過程中對其他細菌生長的抑制有關。β-多樣性分析則表明，鮮樣期與腐敗末期菌群結構差異較大，而腐敗中期與腐敗末期差異較小，這與α-多樣性分析結果相一致。對冷藏小龍蝦優勢腐敗菌的篩選鑒定、細菌群落結構和多樣性分析，為今后利用保鮮技術靶向殺滅腐敗菌、延長貨架期、降低經濟損失提供了一定的理論參考，同時也為今后開發新的小龍蝦品質安全檢測及保鮮殺菌技術提供了思路。

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收稿日期：2022-05-05

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-48）

第一作者簡介：孟凌云（1998—）（ORCID： 0000-0003-3185-2743），女，碩士研究生，研究方向為水產品加工及貯藏。

E-mail： mengly629@163.com

*通信作者簡介：李嬌（1992—）（ORCID： 0000-0002-6058-3725），女，副教授，博士，研究方向為水產品加工及貯藏。

E-mail： lijiao@ouc.edu.cnFE2EA4C7-3244-48AE-9847-AEA3170429DE