畜肉中匹莫林的測定

勇艷華

摘 要：本文建立了檢測畜肉中匹莫林的液相色譜-串聯質譜法。采用乙腈提取，正己烷脫脂，液相色譜-串聯質譜法測定，外標法定量。考察了方法的定量限、標準曲線線性、方法精密度等。結果表明，匹莫林濃度在1～200 μg/L線性良好，相關系數r=0.999 6，定量限為2.0 μg/kg，3個加標水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率為70.8%～85.3%，相對標準偏差為3.0%～5.4%。本方法具有前處理簡單、精密度高、定量限低等優點，能夠滿足畜肉中匹莫林的測定。

關鍵詞：畜肉;匹莫林;液相色譜-串聯質譜

Determination of Pimorin in Animal Meat

YONG Yanhua

（Dalian Center for Certification and Food and Drug Control， Dalian 116630， China）

Abstract： A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of pimorin in meat was established. It is extracted by acetonitrile， degreased by n-hexane， determinated by liquid chromatography-tandem mass spectrometry， external standard method. The quantitative limit， linearity of standard curve and precision of the method were investigated. The results showed that the concentration of pimolin ranged from 1 to 200 μg/L has good linearity， the correlation coefficient is r=0.999 6， and the limit of quantitation is?2.0 μg/kg， 3 spiked levels were 2.0 μg/kg， 4.0 μg/kg， 10.0 μg/kg， the average recovery was 70.8%～85.3%， and the relative standard deviation was 3.0%～5.4%. The method has the advantages of simple pretreatment， high precision and low limit of quantitation， and can be used for the determination of pimolin in animal meat.

Keywords： animal meat; pimorelin; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

匹莫林化學名稱為2-亞氨基-5-苯基-4-惡唑烷酮，是一種中樞神經興奮藥物。通過提高中樞去甲腎上腺素的含量達到中樞興奮的作用，其興奮作用為咖啡因的5倍。雖然農業部176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中禁止匹莫林在飼料和動物飲用水中使用，但仍有飼養者在牲畜飼養過程中違法使用匹莫林，導致匹莫林在畜肉中殘留，對人體健康產生危害。匹莫林的不良反應主要包括對肝功能有損害，從肝酶無癥狀可逆性升高至肝炎、黃疸、肝功能衰竭;可引發再生障礙性貧血;對中樞神經系統有損傷;刺激胃腸道，導致惡心、胃痛;長時間使用可抑制人體生長[1]。因此，建立一種準確快速檢測畜肉中匹莫林殘留的分析方法迫在眉睫，不僅可以打擊違法使用匹莫林的行為，還可為保護消費者健康提供技術支撐。

目前，報道的興奮劑相關檢測方法有膠體金試紙條法[2]、酶聯免疫法[3-5]、化學發光免疫分析[6]、表面增強拉曼光譜法[7]、毛細管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-11]、液相色譜串聯質譜法[12-14]、氣相色譜法[15]、氣質法[16-17]和高分辨質譜法[18-19]，液相色譜串聯質譜法是最常用的方法。文獻中檢測匹莫林的基質為尿液和飼料，但畜肉中匹莫林的檢測暫無報道。本文采用乙腈提取，液相色譜串聯質譜儀進行檢測，建立了畜肉中匹莫林的測定方法。該方法前處理簡單，精密度高，定量限低，能滿足畜肉中匹莫林的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質匹莫林（Pemoline），CAS登錄號2152-34-3，中國食品藥品檢定研究院生產的對照品;甲醇、乙腈、正己烷和甲酸，均為色譜純;氯化鈉，分析純;實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜儀（1290/Agilent 6495，美國Agilent公司）;均質機（IKA）;渦旋混合器（IKA）;超聲波清洗器（科導）;CR21N立式大容量高速離心機（日本Hiachi公司）;氮吹儀（安譜）賽多利斯全自動超純水機（德國Sartorius公司）;Agilent poroshell 120 EC-C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2.5 g（精確到0.01 g）混合均勻的樣品于50 mL離心管中，加入2 mL水，均質1 min，加入5 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取20 min，加入2 mL正己烷，加入1 g NaCl，渦旋混勻1 min，12 000 r/min離心5 min，移取2 mL上層提取液氮吹至近干，準確加入1 mL體積分數為10%乙腈溶解，渦旋混勻1 min，過0.22 μm濾膜，待液相色譜串聯質譜儀檢測。

1.3.2 標準溶液的配制

稱取匹莫林對照品約10 mg（精確至0.1 mg）于小燒杯中，用甲醇溶解并轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，得到濃度為0.1 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冷凍保存。準確移取標準儲備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到濃度為1.0 μg/mL的標準工作溶液，于4 ℃冷藏保存。準確移取10 μL、100 μL、500 μL、1 000 μL和2 000 μL標準工作溶液，分別置于10 mL容量瓶中，10%乙腈定容至刻度，得到濃度為1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L和200 μg/L匹莫林系列標準上機溶液。

1.3.3 添加回收實驗

以不含匹莫林的空白畜肉為基質，添加適量濃度為1.0 μg/mL的標準工作溶液，渦旋混勻1 min，靜置1 h，按1.3.1樣品前處理方法進行實驗。

1.3.4 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Agilent poroshell 120 EC-C18（50 mm×4.6 mm，2.7 μm）;柱溫：35 ℃;流動相：A為0.1%甲酸水（體積分數），B為0.1%甲酸乙腈（體積分數）;梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%A，1.0～4.0 min，90%～0%A;4.0～5.0 min，0%A;5.1～7.0 min，90%A。流速：0.3 mL/min;進樣體積：2 μL。

（2）質譜條件。電噴霧離子源（ESI）;掃描方式：正離子掃描;毛細管電壓：4 000 V;監測方式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）;離子源溫度：200 ℃;去溶劑氣溫度：250 ℃;去溶劑氣：氮氣12 L/min;錐孔氣：氮氣11 L/min。其他參數詳見表1。

2 結果與分析

2.1 提取試劑的選擇

匹莫林難溶于水、乙醚、氯仿、丙酮、苯和稀鹽酸，溶于無水乙醇、丙二醇、甲醇和丙酮，易溶于堿性溶液。本實驗考察甲醇和乙腈提取效果，由于畜肉中含有大量蛋白質和脂肪，用甲醇提取還需進一步用固相萃取小柱凈化，前處理相對煩瑣;但乙腈對蛋白有沉淀作用，用乙腈作為提取試劑，正己烷除脂肪，前處理步驟簡單，除蛋白和脂肪效果較好，因此選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 儀器條件的建立

匹莫林的結構決定了可以在反相色譜上獲得分離，故采用C18色譜柱進行分離，流動相乙腈-水-甲酸混合梯度洗脫。優化了質譜檢測中碰撞能量、脫溶劑氣流速和溫度、錐孔氣流速等參數，確定靈敏度最高、穩定性和重現性最好的選擇性提取離子作為定量離子，次之的作為定性離子。

2.3 線性范圍及檢出限

匹莫林標準工作溶液在1～200 μg/L濃度與峰面積呈線性相關。匹莫林線性方程為Y=5 594.264 692X-

5 371.773 294，相關系數r=0.999 6。以豬肉、牛肉、羊肉為基質，定量向其中添加匹莫林標準溶液，按1.3.1樣品前處理方法提取測定后，質譜峰信噪比≥10

時的添加量確定為本方法的定量限，定量限為2.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

以不含匹莫林的豬肉、牛肉、羊肉為空白基質，將標準工作溶液按2.0 μg/kg、4.0 μg /kg和10.0 μg /kg

3個添加濃度加入空白基質中，考察平均回收率

及6次平行實驗相對標準偏差（RSD），結果如表2所示。平均回收率為70.8%～85.3%，RSD≤5.4%。對豬、牛、羊肉按照本方法進行測試，未發現有本底干擾。

3 結論

本文建立了檢測畜肉中匹莫林殘留的高效液相色譜-串聯質譜方法，匹莫林濃度在1～200 μg/L線性良好，相關系數r=0.999 6，定量限為2.0 μg/kg，3個加標水平2.0 μg/kg、4.0 μg/kg、10.0 μg/kg，平均回收率為70.8%～85.3%，相對標準偏差為3.0%～5.4%，此方法快速、高效、準確且便于操作，可用于畜肉中匹莫林殘留的日常檢測。

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