酶催化橡膠籽油基富含亞麻酸的OPL型結(jié)構(gòu)酯

姚書一 滿佳妮 黃書鋮

摘 要：本文對(duì)無(wú)溶劑體系中的1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）型結(jié)構(gòu)酯的轉(zhuǎn)酯化合成工藝進(jìn)行了研究及優(yōu)化，對(duì)以三棕櫚酸甘油三酯（Tripalmintin，PPP）為原料制備OPL結(jié)構(gòu)酯的方式進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室探究。結(jié)果表明，OPL的最佳合成工藝為PPP與橡膠籽油脂肪酸按摩爾比為1∶7混合，PPP的質(zhì)量為Novozym?的10.0%，以40086脂肪酶為催化劑，在55 ℃和200 r/min的搖臺(tái)下反應(yīng)12 h。在此最優(yōu)條件下，OPL的產(chǎn)率達(dá)到了42.35%。

關(guān)鍵詞：人乳脂替代品;OPL結(jié)構(gòu)酯;轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

Enzyme Catalyzed Rubber Seed Oil-based OPL-Type Structural Ester Rich in Linolenic Acid

YAO Shuyi， MAN Jiani， HUANG Shucheng

（Beijing University of Chemical Technology， Beijing 102200， China）

Abstract： This paper studies and optimizes the transesterification synthesis process of 1-oleic acid-2-palmitate-3-linolate type 1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol （OPL） in a solvent-free system. The production method of OPL structural ester produced from Tripalmintin （PPP） was explored. The results show that the optimal synthesis process of OPL is as follows： PPP is mixed with rubber seed oil fatty acids at a molar ratio of 1：7， with PPP?mass 10.0% Novozym? 40086 lipase as catalyst and reacted in 55℃， 200 r/min shaker for 12 h. Under this optimal condition， the yield of OPL reached 42.35%.

Keywords： human milk fat substitute; OPL structural ester; transesterification reaction

母乳中富含抗體，可以促進(jìn)嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，其中乳脂肪能夠?yàn)閶胗變禾峁┐罅恳子谙盏臓I(yíng)養(yǎng)成分以及能量，這是傳統(tǒng)的動(dòng)物脂肪（如牛羊肉乳脂）和植物脂肪（如棕櫚油和胡麻油等）無(wú)法提供的。在胰脂肪酶的催化下，動(dòng)植物脂肪酸與鈣離子結(jié)合生成不易消化的飽和脂肪酸鈣，使硬度上升，營(yíng)養(yǎng)損失，益生菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制，造成便秘。但由于個(gè)人、社會(huì)等多方面的影響，導(dǎo)致我國(guó)的母乳喂養(yǎng)率較低，市場(chǎng)對(duì)嬰幼兒配方乳粉的需求量極大[1]。通過對(duì)母乳的分析發(fā)現(xiàn)，母乳脂肪的脂肪酸有大量脂肪以1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO）的結(jié)構(gòu)存在。OPO型結(jié)構(gòu)酯在消化時(shí)不會(huì)產(chǎn)生難以消化吸收的飽和脂肪酸鈣，有利于嬰幼兒吸收營(yíng)養(yǎng)。因此，OPO結(jié)構(gòu)酯是目前國(guó)內(nèi)外市面上常見的高端嬰幼兒奶粉的營(yíng)養(yǎng)添加劑成分之一。但是，由于中國(guó)母體膳食結(jié)構(gòu)原因，母乳中亞油酸含量較高，且導(dǎo)致亞油酸/亞麻酸較高，高于推薦值。現(xiàn)有母乳脂肪替代品（OPO）的不飽和脂肪酸組成和中國(guó)母乳的不飽和脂肪酸組成存在一定差異，因此需要開發(fā)一種更適合中國(guó)嬰幼兒食用的奶粉營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。筆者認(rèn)為1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油三酯（1-oleoyl-2-palmitoyl-3-linoleoylglycerol，OPL）更適合作為中國(guó)嬰幼兒食用奶粉的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，以代替OPO型結(jié)構(gòu)酯。對(duì)比了解多種動(dòng)植物原料中的成分后，發(fā)現(xiàn)橡膠籽油較為適合作為OPL型結(jié)構(gòu)酯的合成原料[2]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

硫酸，98% AR;碳酸氫鈉，AR;氫氧化鉀，AR;乙醇，95% CP;Novozym?435，1 000 PLU/g，Novozymes;Novozym? 40086，275 IUN/g，Novozymes;Lipozym TL IM，250 IUN/g，Novozymes;Candida sp.99-125，38 KLU/g;正己烷，AR;無(wú)水硫酸鈉，AR;氯化鈉，AR。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定酶類型對(duì)酯轉(zhuǎn)換過程的影響

產(chǎn)酶菌株和固定化方法不同，脂肪酶活性、底物選擇和最佳反應(yīng)條件存在很大差異，因此選擇合適的脂肪酶在酯轉(zhuǎn)換化制備OPL過程中非常重要。選擇Novozym?435，Lipozyme TL IM，Novozym? 40086和Candida sp.99-125作為轉(zhuǎn)酯化酶，分別研究了不同類型的脂肪酶對(duì)轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的影響。以PPP∶橡膠籽油脂肪酸=1∶7為底物，添加PPP質(zhì)量10%的脂肪酶，在55 ℃，200 r/min的條件下，在搖床設(shè)備上催化反應(yīng)24 h。通過測(cè)量甘油三酯（Triacylglycerol，TAG）的含量來(lái)比較轉(zhuǎn)化速度的快慢。

1.2.2 溫度對(duì)脂肪酶活性有決定性的影響

一般情況下，當(dāng)溫度適當(dāng)升高時(shí)，酶催化反應(yīng)的活性會(huì)增加，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的不可逆變性和生物活性的喪失。因此，研究實(shí)驗(yàn)過程中的最適溫度也是研究的熱點(diǎn)之一。以45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃為溫度變量，在Novozym? 40086的基礎(chǔ)上，振蕩反應(yīng)24 h，每4 h用氣相色譜法測(cè)定一次樣品中各組分的表征[4]。

1.2.3 脂肪酶添加量對(duì)水解反應(yīng)的影響

在反應(yīng)過程中，脂肪酶先通過活性位點(diǎn)與底物結(jié)合形成中間復(fù)合物。當(dāng)脂肪酶的用量達(dá)到一定濃度時(shí)，其對(duì)反應(yīng)的積極作用逐漸減弱[5]。同時(shí)，過多的脂肪酶會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此，不同脂肪酶對(duì)轉(zhuǎn)酯化程度的影響也是生產(chǎn)過程中考量的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究同種催化脂肪酶Novozym? 40086在不同的用量條件下（3%、5%、10%和15%）對(duì)轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)OPL結(jié)構(gòu)酯的影響。

1.3 油脂酸價(jià)的測(cè)定

PPP樣品油的酸值按GB 5009.229—2016[3]進(jìn)行測(cè)定。取少量油樣，準(zhǔn)確稱量，加入20 mL中性乙醇醚（1∶1）溶液，用超聲波機(jī)溶解樣品，加入2滴酚酞，得到待測(cè)溶液。用預(yù)先校準(zhǔn)的氫氧化鉀乙醇溶液滴定，濃度約為0.1 mol/L，當(dāng)溶液開始出現(xiàn)粉紅色停止滴定，按下式計(jì)算油的酸值：

式中：Av為樣品酸價(jià)，mg/g;56.11為KOH的摩爾質(zhì)量，單位mg/mmol;C為氫氧化鉀-乙醇溶液濃度，mol/L;V為氫氧化鉀-乙醇溶液消耗體積，mL;m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定酶類型對(duì)酯轉(zhuǎn)換過程的影響分析

由圖1知，各脂肪酶的初始產(chǎn)率均較高，但隨著反應(yīng)過程的進(jìn)行，脂肪酶的催化效率逐漸降低，12 h后反應(yīng)體系中不同TAG的含量趨于平衡。Lipozyme? TL IM和Novozym? 40086的催化反應(yīng)率和OPL產(chǎn)率（36.300%和37.540%）均高于Candida sp.99-125與Novozym? 435脂肪酶（30.585%和34.545%）。然而，如表1所示，使用Lipozyme TL IM的體系中，總甘油酯（Glycerin Ester，GLE）的比例遠(yuǎn)低于使用Novozym? 40086的體系中TAG的比例。這意味著使用Novozym? 40086的體系中TAG的水解量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Lipozyme? TL IM，因此本實(shí)驗(yàn)選用Novozym? 40086作為催化脂肪酶。

2.2 溫度對(duì)水解反應(yīng)的影響

由圖2可知，反應(yīng)在初始階段，反應(yīng)速率隨著溫度的升高而快速上升。在55 ℃環(huán)境下，反應(yīng)平衡時(shí)（即反應(yīng)12 h后）產(chǎn)量為39.31%，而在60 ℃下，平衡時(shí)僅為35.62%，可推斷出脂肪酶在過高的溫度下發(fā)生了部分失活。雖然產(chǎn)量仍然比45 ℃、20 ℃高，但是綜合考慮生產(chǎn)成本條件和酶的可持續(xù)使用特點(diǎn)，得出在55 ℃時(shí)條件最適宜。

2.3 脂肪酶添加量對(duì)水解反應(yīng)的影響

由圖3可知，不考慮脂肪酶Novozym? 40086用量比為3%時(shí)的反應(yīng)測(cè)定，不同脂肪酶添加量下的催化效果在12 h后達(dá)到平衡。

在水平對(duì)比劑量下，反應(yīng)速率隨脂肪酶用量的增加而增加，平衡時(shí)反應(yīng)產(chǎn)率也呈正增加。但當(dāng)脂肪酶含量從PPP的10%增加到15%時(shí)，反應(yīng)速率沒有顯著增加，最終產(chǎn)物中OPL的產(chǎn)率為43.17%，與10%的產(chǎn)率（42.35%）相近。因此，綜合考慮OPL產(chǎn)量和生產(chǎn)成本，選擇10%的PPP酶劑量是最合適的。

3 結(jié)論

本文從橡膠籽中提取出OPL結(jié)構(gòu)酯運(yùn)用到高端的乳粉中，研究了不同酶、不同溫度下、不同反應(yīng)途徑下，如何高效地提取出OPL結(jié)構(gòu)酯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富含亞麻酸、亞油酸的橡膠籽油脂肪酸作為原料可以高效產(chǎn)出OPL結(jié)構(gòu)酯，并有效防止Sn-2棕櫚酸的轉(zhuǎn)移。以橡膠籽油中的脂肪酸為基礎(chǔ)，研究了轉(zhuǎn)酯化制備OPL結(jié)構(gòu)酯的生產(chǎn)過程，PPP∶橡膠籽油=1∶7（摩爾比），加入10 wt%（以PPP質(zhì)量計(jì)）的Novozym? 40086脂肪酶，脫水處理，在55 ℃下，200 r/min反應(yīng)12 h，可以實(shí)現(xiàn)OPL產(chǎn)率為42.35%。 符合國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，使生產(chǎn)技術(shù)日后用于大量生產(chǎn)OPL結(jié)構(gòu)酯成為可能。

參考文獻(xiàn)

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[3]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定：GB 5009.229—2016[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2017.

[4]Zhang X， Nie K L， Zheng Y L，et al.Lipase Candida sp. 99-125Coupled with β-cyclodextrin as additive synthesized the human milk fat substitutes[J].Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic，2016，125：1-5.

[5]Wei W， Feng Y F， Zhang X，et al.Synthesis of structured lipid 1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol in both solvent and solvent-free system[J].LWT - Food Science and Technology，2015，60（2 ）：1187-1194.