血清和尿液Hugl- 2基因甲基化檢測(cè)對(duì)腎細(xì)胞癌的診斷價(jià)值

李朝輝，程任權(quán)，李瑤，王鑫淼，楊小麗

(臨汾市中心醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科,2.腫瘤科,山西 臨汾 041000)

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

1.2 一般資料

本研究所使用的腫瘤組織、腎實(shí)質(zhì)、血清和尿液樣本，均來(lái)自2018年5月至2021年3月在本院泌尿外科接受根治性腎切除術(shù)的148例RCC患者(RCC組)，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療。確診時(shí)患者的中位年齡為64歲(21～84歲)。同時(shí)，從參加預(yù)防性醫(yī)學(xué)檢查的非癌人群中提取150例(非癌對(duì)照組人群)血清樣本和尿液樣本，非癌對(duì)照組人群中位年齡65歲(18～85歲)，沒有任何患有惡性腫瘤的臨床證據(jù)和高危因素(鼻咽癌病史、吸煙、飲酒、經(jīng)常食用腌制或鹽漬食品)，且無(wú)任何毒化學(xué)品職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)。兩組年齡、性別構(gòu)成比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。冷凍生物樣本,-80 ℃下儲(chǔ)存直到處理完畢。所有參與者均獲得書面知情同意，且本研究亦獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 血液和尿液采集 入組次日上午(8:00～10:00)從每個(gè)受試者處抽取靜脈血10 ml,并收集大約13 ml的現(xiàn)場(chǎng)尿液，置于冰箱中直至離心。取上清液在-80 ℃保存。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

A. TCGA樣本RCC組織和正常組織中Hug 2 mRNA表達(dá)；B. CPRAC樣本RCC組織和正常組織中Hug 2蛋白表達(dá)；C. Hug 2 mRNA表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系；D. Hug 2 mRNA表達(dá)與患者總生存預(yù)后的關(guān)系；E. TCGA樣本RCC組織Hug 2基因甲基化水平(淡色字體表示CpG島)；F. 基于LinkedOmics工具，RCC組織Hug 2基因甲基化水平與TNM病理學(xué)分期的關(guān)系；G. RCC組織Hug 2基因甲基化水平與T分期的關(guān)系；H. RCC組織Hug 2基因甲基化水平與患者總生存預(yù)后的關(guān)系圖1 基于生物信息學(xué)工具分析Hugl- 2 mRNA在RCC組織中的表達(dá)和甲基化情況

2.2 RCC組織中Hug 2基因甲基化水平

經(jīng)甲基化特異性PCR法檢測(cè)，RCC組織標(biāo)本中Hugl- 2基因甲基化水平高于相配對(duì)的癌旁非癌腎實(shí)質(zhì)組織樣本[0.342(0.128，0.803)vs.0.032(0.007，0.102)，Z=-12.090，P<0.001，圖2A]。此外，RCC組患者血清樣本[0.078(0.033，0.186)vs.0.019(0.010，0.064)，Z=-6.881，P<0.001]和尿液樣本[0.123(0.078，0.218)vs.0.023(0.014，0.059)，Z=-8.752，P<0.001]中Hugl- 2基因甲基化水平亦高于非癌對(duì)照組人群。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析，RCC組患者血清樣本和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平均與腫瘤組織樣本中Hugl- 2基因甲基化水平呈正相關(guān)(rs值分別為0.352、0.486，均P<0.001，圖2B和圖2C)。

A. RCC組織和相配對(duì)的癌旁非癌腎實(shí)質(zhì)組織樣本Hugl- 2基因甲基化水平；B. 腫瘤組織與血清樣本中Hugl- 2基因甲基化水平的關(guān)系；C. 腫瘤組織與尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平的關(guān)系圖2 Spearman相關(guān)系數(shù)分析

2.3 RCC組織、血清和尿液樣本中Hug 2基因甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

表1 RCC組織、血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 血清和尿液Hug 2基因甲基化水平對(duì)RCC的診斷價(jià)值

經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平診斷RCC的AUC分別為0.818(95%CI：0.770～0.867)和0.958(95%CI：0.935～0.980)，且尿液樣本的AUC大于血清樣本(Z=-0.498，P<0.001，圖3)。

圖3 血清和尿液Hugl- 2基因甲基化診斷RCC的ROC曲線

3 討 論

臨床上RCC早期診斷率較低，通常只是在對(duì)非特異性癥狀或其他腹部疾病進(jìn)行影像學(xué)檢查時(shí)才被診斷出來(lái)，因此迫切需要更有效的早期診斷技術(shù)[2]。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物表觀遺傳修飾中研究最為廣泛的一種，它可以通過抑制腫瘤的抑制基因的表達(dá)而促進(jìn)腎臟腫瘤的發(fā)生。作為穩(wěn)定的、可以定量檢測(cè)的DNA標(biāo)志物，腫瘤組織中DNA甲基化是一種潛在的早期檢測(cè)、預(yù)測(cè)治療反應(yīng)及預(yù)后的生物標(biāo)志物。在本研究中我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)Hugl- 2基因啟動(dòng)子上的CpG基因位點(diǎn)是影響其在RCC中表達(dá)的可能調(diào)節(jié)因子。此外，Hugl- 2 mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)性。為了證實(shí)該推斷的可靠性，我們收集了近3年在我院泌尿外科接受根治性腎切除術(shù)的RCC患者的組織標(biāo)本，證實(shí)RCC腫瘤組織、血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平普遍升高，且Hugl- 2基因甲基化與RCC患者臨床病理分期有關(guān)。結(jié)果表明RCC中Hugl- 2蛋白表達(dá)下調(diào)可能是由異常的啟動(dòng)子甲基化引起的。盡管在RCC中Hugl- 2表達(dá)下調(diào)的機(jī)制是潛在的，本研究結(jié)果表明Hugl- 2基因甲基化水平可能是這種癌癥的特異性生物標(biāo)志物。

細(xì)胞極性是細(xì)胞的不對(duì)稱性分裂、細(xì)胞的遷移、細(xì)胞的免疫、神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)等生理過程的重要基礎(chǔ)[8]。細(xì)胞極性的建立和維持對(duì)于胚胎和個(gè)體發(fā)育的過程是必需的，在病理?xiàng)l件下丟失細(xì)胞極性會(huì)嚴(yán)重影響機(jī)體發(fā)揮正常功能而形成腫瘤并且發(fā)生轉(zhuǎn)移。Lgl編碼一種保守的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞極性、不對(duì)稱分裂和增殖控制中具有已確立的作用。Lgl功能的喪失會(huì)導(dǎo)致極化上皮組織的破壞，并影響調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的信號(hào)通路，而這些信號(hào)通路與人類癌癥有關(guān)[5]。Calleja等[9]研究發(fā)現(xiàn),在果蠅的三齡幼蟲階段Lgl的缺失會(huì)導(dǎo)致侵入性神經(jīng)和上皮腫瘤的發(fā)生。另外，在神經(jīng)干細(xì)胞中Lgl被證明與非典型蛋白激酶C(aPKC)/PAR極性復(fù)合物相互作用并拮抗，以控制尖基極性和細(xì)胞增殖[10]。

綜上，Hugl- 2基因異常DNA甲基化是癌變過程中的一個(gè)早期事件，并隨著腫瘤的發(fā)展逐漸明顯。因此，檢測(cè)血清或尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平有望成為RCC的診斷手段，尤其檢測(cè)尿液中Hugl- 2基因甲基化水平。