超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中20 種常用獸藥殘留量的研究

陳錫龍，趙 貴，黃 鑫，謝麗麗，王慶紅，孫真崢，楊 強

貴州省獸藥飼料檢測所，貴州貴陽 550003

0 引言

獸藥，是指用于預防、治療、診斷動物疾病或者有目的地調節動物生理機能的物質[1]。獸藥殘留是指食品動物使用獸藥后，動物產品的任何可食用部分中所有與藥物有關的物質殘留，包括原型藥物或（和）其他代謝產物[2]。牛奶中的獸藥殘留主要是養殖過程中獸藥濫用或使用不當造成的，這種情況可稱之為主動行為；不排除少數被動行為可能造成獸藥殘留超標的情況，如在不知情的情況下使用含有某種非法添加獸藥成分的中獸藥等。牛奶中獸藥殘留超標對人體特別是嬰幼兒健康有著嚴重影響，長期食用獸藥殘留超標的牛奶，可能導致獸藥殘留蓄積，引起毒害損傷，甚至致畸、致癌[3]。為應對牛奶中獸藥殘留超標，我國于2019年9月發布的《GB 31650—2019食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定了牛奶中81 種獸藥的最大殘留限量[4]，進一步完善了國內奶牛有關獸藥使用的規范和標準[5]。

獸藥殘留檢測是保障牛奶質量安全的重要手段和措施。但是，由于獸藥種類繁多，如果逐一進行檢測，則效率低下，且成本高昂，而高通量檢測技術可以一次性檢測多種獸藥殘留，省時省力，因此成為當前研究的熱點[6]。我國針對牛奶中獸藥殘留的檢測已出臺多項相關標準[7~11]。目前，國內外對單類獸藥殘留的檢測技術已日漸成熟，但對多類獸藥殘留檢測的研究則較少，且不夠充分。這是由于同時測定多類獸藥殘留存在較多難點，如獸藥種類多、性質差異大，前處理技術無法兼顧所有藥物而使回收率、定量下限等不能滿足測定要求[12]。

近年來的研究表明，超高效液相色譜-串聯質譜測定法在多種類獸藥殘留檢測方面具有明顯優勢，已成為當前研究的主流。例如，王浩等[13]利用液相色譜－串聯質譜測定法測定了牛奶中五類35 種抗生素殘留；李寧等[14]開發了牛奶中四類25 種抗生素殘留的檢測方法；方靈等[15]建立了同時測定牛奶中五類38 種抗生素殘留的分析方法；張炯愷[16]建立了高效液相色譜-串聯質譜法快速測定乳制品中十類90 種獸藥殘留量的方法。這些方法的研究為牛奶中多種獸藥殘留的快速檢測提供了重要借鑒和參考，但尚不滿足作為檢測標準的條件，仍需繼續優化和探索。

本文使用乙腈處理牛奶樣品并結合超高效液相色譜串聯質譜法建立了七類20 種常用獸藥在牛奶中殘留量的檢測方法，取得了滿意的結果。20 種獸藥包括3 種β-內酰胺類、4 種喹諾酮類、1 種大環內酯類、1 種林可酰胺類、9 種磺胺類、1 種增效劑類和1 種激素類藥物，均為使用廣泛的獸藥。該方法對于牛奶中多類別、多組分獸藥殘留的分析監測和快速篩查具有良好現實基礎和參考價值。

1 材料和方法

1.1 儀器設備

Waters-UPLC Xevo TQ-XS高效液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源及MassLynx數據處理系統，美國沃特士公司；Denver Instrument TB-215 D型電子分析天平，美國丹佛公司；Mettler Toledo ME802E型電子天平，美國梅特勒-托利多集團公司；FV64全自動智能氮吹儀，廣州得泰儀器科技有限公司（Detelogy）：艾卡（IKA MS3）旋渦混合器，德國艾卡-沃克股份兩合公司。

1.2 標準物質及試劑

阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林、泰樂菌素、環丙沙星、氧氟沙星、達氟沙星、恩諾沙星、林可霉素、甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、地塞米松，中國獸醫藥品監察所和中國食品藥品檢定研究院；泰樂菌素A（泰樂菌素殘留標志物），TOKU-E公司；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，德國Merck公司；實驗用水為經Milli-Direct-Q8UV-R凈化系統（美國Millipore公司）制備的超純水；試驗所用牛奶樣品均為實驗室檢測留樣。

1.3 色譜及質譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×150 mm。流動相A為0.2%甲酸水溶液，流動相B為0.2%甲酸乙腈。線性梯度洗脫程序：0~0.5 min，10%B；0.5~11.0 min，10%B上升至90%B；11.0~11.50 min，90%B保持0.5 min；11.50~11.60 min，90%B至10%；11.60~14.00 min，10%B保持2.4 min。流速：0.3 mL/min。柱溫：40 ℃。樣品溫度：10 ℃。進樣量：2 μL。

1.3.2 質譜測定條件

電噴霧離子源，正離子掃描；多反應監測模式；離子源入口電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；霧化氣流速：550 L/h；21 種化合物質譜采集參數見表1。

表1 21種化合物質譜參數及保留時間

1.4 標準溶液的制備

1.4.1 單標標準儲備液的制備

（1）甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松單標標準儲備液的制備

稱取甲氧芐啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松各約50 mg，需折算為凈含量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，用甲醇定容，搖勻，配制成各成分凈含量為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，4~8 ℃冰箱中保存。

（2） 磺胺喹噁啉單標標準溶液的制備

稱取磺胺喹噁啉約50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL使溶解，用甲醇定容，搖勻，得含磺胺喹噁啉濃度約為1.0 mg/mL的標準儲備溶液，4 ~8 ℃冰箱中保存。

（3）環丙沙星、氧氟沙星、達氟沙星、恩諾沙星、泰樂菌素單標標準溶液的制備

稱取環丙沙星、氧氟沙星、達氟沙星、恩諾沙星、泰樂菌素各約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標準工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。

（4）泰樂菌素A單標標準溶液的制備

稱取約5 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標準工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。（5）阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林單標標準溶液的制備

各按凈含量稱取阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，配制成各成分凈含量為100 μg/mL的標準工作溶液，因其容易分解，須臨用前現配。

1.4.2 混合標準溶液的配制

取各含量為1.0 mg/mL的標準儲備溶液各1.00 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得濃度為10 μg/mL混合標準中間溶液；另取上述混合標準中間溶液1.00 mL，置預先放入適量水的量瓶中，再加入其余含量為100 μg/mL的各標準工作（或貯備）溶液100 μL，加水稀釋并定容，搖勻，即得各化合物濃度為100 ng/mL的混合標準工作溶液。

1.4.3 混合標準工作曲線系列溶液的配制

（1）空白樣品基質的制備

稱取空白牛奶樣品2.0 g，按1.6 樣品處理方法從“置50 mL離心管中，”開始，一直到“室溫氮吹濃縮至約1 mL，取出，渦旋10~30 s”為止，處理所獲得的溶液即為空白樣品基質。

（2）合標準工作曲線系列溶液的配制

分別將5 份空白樣品基質轉移到2 mL量瓶中，再分別加入濃度為100 ng/mL的混合標準工作溶液10 μL、20 μL、40 μL、100 μL和200 μL，加水稀釋定容，渦旋混勻，即得濃度分別為0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL的混合標準工作曲線系列溶液。

1.5 磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪特征離子色譜峰保留時間的確定

因磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪互為同分異構體，需要配制各自適合上機測試濃度的單標標準溶液進行測試，以確定其特征離子色譜峰的保留時間，否則易造成識別誤判。

1.6 樣品的處理

稱取2.0 g牛奶樣品，置50 mL離心管中，加入4 mL乙腈處理，渦旋10~30 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液過Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，收集洗脫液于10 mL玻璃試管中；殘渣加入2 mL乙腈洗滌，洗液過Oasis PRiME HLB固相萃取柱，合并洗脫液，室溫氮吹濃縮至約1 mL，取出，渦旋10~30 s，轉移至具刻度的10 mL塑料離心管中，加少量水洗滌試管，洗液合并于離心管中，加水稀釋至2.0 mL，渦旋，混勻，10 000 r/min離心5 min，取上清液適量過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.7 檢出限和定量限

選取適當的空白牛奶樣品，按1.4.3（1）空白樣品基質的制備方法制得空白樣品基質，添加適量的21 種化合物的濃度均為100 ng/mL的混合標準工作溶液，加水定容至2 mL，渦旋混勻后過濾膜，取濾液上機測定。以特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，S/N≥10的濃度為方法定量限。

1.8 準確度和精密度

采用標準添加法進行加標回收試驗。分別在2.0 g空白牛奶中加入濃度為100 ng/mL的混合標準工作溶液40 μL和200 μL，制得添加量為2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的陽性添加樣品，按1.6 樣品處理方法處理后上機測定，每個添加水平分別作5 個平行，每個平行進樣2 針。計算平均回收率和相對標準偏差，考察方法的準確度和精密度。

1.9 實際樣品的測定

對51 批實驗室中留樣的牛奶樣品進行了檢測。

1.10 泰樂菌素殘留物的檢測

因《GB31650—2019食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規定泰樂菌素的殘留標志物為泰樂菌素A，故本研究同時考察了泰樂菌素及其殘留標志物泰樂菌素A的添加回收及檢測情況。

2 結果與討論

2.1 線性范圍

按1.4.3混合標準工作曲線系列溶液的配制方法配制21 種化合物混合標準工作系列溶液上機測定。21 種化合物混合標準溶液（2 ng/mL）總離子流圖見圖1，21 種化合物的出峰順序和保留時間見表1。21 種化合物分離度良好，響應靈敏。以各化合物定量離子色譜峰峰面積為縱坐標，其相應質量濃度為橫坐標，繪制21 種化合物的線性回歸方程。結果表明：21 種化合物在0.5~10.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數R2均大于0.991。21 種化合物的線性回歸方程及相關系數數據見表2。

圖1 21種化合物混合標準溶液（2 ng/mL）總離子流圖

2.2 檢出限和定量限

采用空白基質添加目標化合物的方法，以特征離子質量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為方法檢出限，S/N≥10的濃度為方法定量限，該方法的檢出限為0.02~0.4 μg/kg；定量限為0.05~1.2 μg/kg。各化合物的檢出限和定量限數據見表2。空白樣品圖譜見圖2。

表2 21 種化合物線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限

圖2 牛奶空白樣品總離子流圖

2.3 準確度和精密度

采用標準添加法進行加標回收試驗。按照1.8的方法，制得添加量為2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的陽性添加樣品，按1.6樣品處理方法處理后上機測定。陽性添加牛奶樣品總離子流圖見圖3。按內標法計算含量，求得21 種化合物的平均回收率為60.6%～93.2%，相對標準偏差為0.8%~17.9%，各化合物的回收率及相對標準偏差數據見表3。

表3 21種化合物在陽性添加樣品中的回收率和相對標準偏差

圖3 陽性添加牛奶樣品總離子流圖（添加量為2.0 μg/kg）

2.4 實際樣品的檢測

對51 批實驗室中留樣的牛奶樣品進行了檢測。結果表明：絕大多數獸藥未檢出殘留，少數獸藥雖檢出殘留，但均未超過國家規定的最大殘留限量。

2.5 色譜條件的優化

參考方靈等[15]的研究，選用ACQUITY UPLC ?HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）色譜柱對21 種化合物進行分離。使用0.2%甲酸乙腈作為有機相，考察選取0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L乙酸銨和5 mmol/L甲酸銨作為水相，采用梯度洗脫方式對21 種化合物進行分離，結果表明，選用0.2%甲酸水作為水相時，21 種化合物的分離度和峰形較優。故選用0.2%甲酸水作為水相，用0.2%甲酸乙腈作為有機相。

2.6 質譜條件的優化

方法采用蠕動進樣方式向質譜系統注入500 ng/mL的單一標準溶液，確定化合物的最佳質譜條件。各化合物標準溶液經超高效液相色譜流動相帶入ESI電離源，進行一級全掃描質譜分析。在正離子模式下對[M+H]+進行子離子掃描，得到主要的離子，并選擇響應值高的離子進行碰撞能量優化，最終確定了多反應離子監測的離子對及碰撞能量，建立了相應的質譜參數。特別地，化合物中磺胺對甲氧嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯噠嗪互為同分異構體，建立質譜參數后，分別以濃度為5 ng/mL的上述4 種化合物單標標準溶液通過液相系統經色譜柱注入質譜儀，確定其相應的保留時間，利用保留時間進行定性，從而避免識別誤判。

2.7 提取溶劑的選擇和前處理條件的優化

牛奶基質復雜，前處理主要是沉淀蛋白和除脂，本研究主要選擇乙腈、0.2%的甲酸乙腈和5%的三氯乙酸溶液沉淀牛奶中的蛋白，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化除脂。采用乙腈、0.2%的甲酸乙腈沉淀蛋白，方法簡單快捷，省時省力，但研究中發現采用0.2%的甲酸乙腈處理樣品后，磺胺類化合物的回收率普遍偏低，一般只有30%~40%，且基質干擾較大，故最終選擇用乙腈作為提取溶劑。為充分提取化合物殘留，選擇用2 mL乙腈洗滌殘渣一次，但并非洗滌次數或乙腈使用量越多越好。氮吹濃縮時保持室溫不加熱為宜，以免較高的溫度加速某些化合物的分解。氮吹濃縮至1 mL左右，以除去絕大部分的乙腈即可，繼續吹干也需要復溶，且會花費較多的時間。氮吹濃縮后的樣品仍含有少量蛋白，直接過濾膜會比較困難，故選擇轉移定容后離心，反而使處理更加快捷和高效。

2.8 單標標準溶液或貯備液的配制

根據化合物性質的差異，配制單標標準溶液或貯備液時采用了不同的配制方法。例如，對于在甲醇中溶解度為微溶或以上且性質穩定的化合物一般配制為1.0 mg/mL的標準貯備液，以便較長時間保存；對于在甲醇中溶解度為極微溶解或以下且性質穩定的化合物一般配制為100 μg/mL的標準貯備液。對于阿莫西林、氨芐西林、苯唑西林等在甲醇中容易分解，但在水中相對穩定的化合物，則用水作溶劑臨用時現配。個別較昂貴且購買時裝量極少的化合物，如泰樂菌素A，則配制為100 μg/mL的標準貯備液。幾乎不溶于甲醇或水的磺胺喹噁啉，則加了少量堿性溶液進行溶解處理。混合標準溶液均為現用現配。

3 結論

研究建立的牛奶中20 種常用獸藥殘留量測定的超高效液相色譜串聯質譜法，使用乙腈沉淀蛋白，經Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化除脂，再氮吹濃縮后加水定容離心，上機測定，獲得了較滿意的結果。方法測定的獸藥種類覆蓋范圍廣，且均為使用廣泛的獸藥，具有較強的針對性。同時，方法前處理簡單，方便快捷，準確度和靈敏度高，可作為牛奶中常用獸藥殘留量的快速篩查和定量方法。