一株耐酸、高產淀粉酶酵母菌的篩選及初步鑒定

陳闊 歐陽英 何天翔 盧煒琪 尹樂斌

摘 要：目的：篩選出邵陽地區大曲中耐酸、高產淀粉酶微生物并對其相關生物學特性進行研究。方法：采用搖瓶發酵法與碘顯色法，從湘窖酒曲中初步篩出3株菌落直徑與透明圈直徑比值較大的菌株WB4、WB9、WB13，分別將其在室溫下放置1 h后，采用DNS法測定其酶活。結果：WB4菌株的酶活力最高，該菌株的最適反應溫度為32 ℃，在該條件下獲得淀粉酶活性為2.877 U/mL，其最耐受酒精濃度為10%。結論：耐酸、高產淀粉酶菌株WB4的篩選對于釀酒行業具有良好的應用前景，減少了釀酒過程中的酸堿調節步驟，在酸性條件下，許多其他雜菌因無法適應這一條件而被抑制，為工業生產帶來了巨大的經濟效益。

關鍵詞：邵陽大曲;耐酸;高產;淀粉酶;篩選;鑒定

Screening and Preliminary Identification of an Acid Tolerant and High Amylase Producing Yeast

CHEN Kuo， OUYANG Ying， HE Tianxiang， LU Weiqi， YIN Lebin*

（Colleage of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective： To screen out the acid-tolerant and high-yielding amylase microorganisms from Daqu in Shaoyang area and study their related biological characteristics. Method： Three strains WB4， WB9 and WB13 with large ratio of colony diameter to transparent circle diameter were screened from Xiangjiao distiller’s yeast by shaking flask fermentation and iodine colorimetry. After being placed at room temperature for 1 h， their enzyme activities were determined by DNS method. Result： The enzyme activity of strain WB4 was the highest， and the optimum reaction temperature of this strain was 32 ℃. The amylase activity obtained under this condition was 2.877 U/mL， and its maximum tolerance to alcohol concentration was 10%. Conclusion： The screening of this acid-resistant and high-yielding amylase strain WB4 has good application prospects for the winemaking industry， reducing the acid-base adjustment steps in the winemaking process. Under acidic conditions， many other miscellaneous bacteria cannot adapt to this condition. Inhibition has brought huge economic benefits to industrial production.

Keywords： Shaoyang Daqu; acid tolerance; high yield; amylase; screening; identification

大曲的主要原料是小麥，形狀類似磚塊，具有豐富的菌系和酶系，是一種釀酒用的糖化劑及發酵劑，且含有多種能水解和發酵底物的產酶微生物。釀酒的主要原料由高粱、小麥、玉米等組成，其中含有大量淀粉，淀粉是自然界中的第二大多糖儲備物質，是許多食品與非食品行業的重要組成部分[1]。大曲中能產生淀粉酶的微生物有霉菌、酵母菌、青霉菌和細菌等，其中淀粉酶已被廣泛運用于釀酒、紡織與烘焙等行業生產，除動物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外兩大來源是植物和微生物[2]。

為解決釀酒過程中淀粉漿液化糖化中的調溫度與調節pH等步驟，本文通過考察形態學、生理生化特性，利用液體發酵法對產淀粉酶培養基發酵條件進行優化，從邵陽大曲中篩選出了一株耐酸、高產淀粉酶的酵母菌。而在不同的地域制備的大曲，其微生物多樣性可能存在不同。張雙燕[3]利用MiSeq高通量技術分析北京地域的清香型大曲微生物多樣性，得出真菌中的優勢菌是假絲酵母、曲霉屬等。胡曉龍[4]使用同樣的方法對河南省地域的大曲微生物群落多樣性進行分析，得出真菌中優勢菌種是扣囊復膜酵母、雪黃散囊菌等。由此得出不同地域的氣候、地勢環境、大曲制作方法的不同均可能對大曲中微生物的多樣性產生影響。對于白酒行業來說，篩選出具有地域特色的高品質微生物能提升出酒率和酒的品質，進而改善傳統制曲工藝。故此，對湖南邵陽地區的大曲微生物的篩選與研究顯得極為必要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

湖南省邵陽市湘窖酒業有限公司高溫包包曲。

1.1.2 主要培養基與試劑

（1）培養基。①初始發酵培養基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、自來水1 L、pH 值7.0，121 ℃滅菌25 min。②初選培養基：玉米淀粉20 g、K2HPO4 1.0 g、NaNO3 3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂粉13 g、氯霉素0.005 g、定容至1 L錐形瓶中，pH值 5.5～6.0，121 ℃滅菌25 min。③馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。④YEPD培養基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，115 ℃濕熱滅菌20 min。

（2）試劑。硝酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、麥芽糖、3，5-二硝基水楊酸、酵母膏和瓊脂粉等由邵陽學院生化實驗室提供;氯霉素購于藥店。

1.1.3 主要儀器設備

LE438型pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DH-420型電熱恒溫培養箱：北京科偉永興儀器有限公司;UV-3802型紫外分光光度計：重慶萬達儀器有限公司;H21-6型電熱恒溫水浴鍋：北京市東霞電子儀表廠;JI54DWS型高壓蒸汽滅菌鍋：致微廈門儀器有限公司等。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲發酵

取1 g大曲接種于發酵培養基中，40 ℃，150 r/min振蕩培養24 h。

1.2.2 菌株初篩

取發酵培養液1 mL，于99 mL的無菌水三角瓶中，振蕩均勻，即為稀釋度10-2的粉末懸液。再依次進行梯度稀釋，獲得稀釋度為10-3、10-4、10-5和10-6的大曲稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL涂布于篩選平板上，28 ℃恒溫箱中培養24 h。挑取培養基上不同形態的菌落進行平板劃線，得到單個菌落。噴灑碘液，若菌落出現白色透明圈，則說明此菌可產生淀粉酶，挑選有透明圈的菌落備用，并制作表格統計D/d值，初步篩選產淀粉酶菌株。

1.2.3 菌株復篩

高產淀粉酶菌株的篩選：將初篩出的純菌種接種于250 mL發酵培養基中，37 ℃、250 r/min搖床培養2 d。取發酵液1 mL于8 000 r/min下離心10 min，取上清液測酶活力，每個樣品重復3次，結果取平均值。

1.2.4 耐酸性篩選

將篩選出的兩株高產性菌株分別同時接種于YPED液體培養基中，28 ℃恒溫培養1 d，種子活化液濃度為1.0×107 CFU/mL，設置5個不同梯度的pH值，pH分別為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，28 ℃恒溫培養箱中培養3 d，吸取2×105 CFU/mL菌液1 mL于上述不同pH值的100 mL YPED液體培養基中，利用紫外分光光度計測定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，菌株的耐酸性越強[5-6]。

1.2.5 酶活測定方法

（1）測定方法。采用DNS法[7]測菌株的酶活力，以麥芽糖繪制標準曲線，測定試驗菌株在520 nm的吸光度。

（2）標準曲線的繪制。①取16支潔凈比色管分別編號1、2、3、4、5和6（除6號試管1支外，其他每組編號各3支），用蒸餾水沖洗，于培養箱中烘干，之后分別往比色管中依次加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL和2.0 mL麥芽糖標準溶液，DNS指示劑，蒸餾水（加入量參考文獻[8]）。②搖勻后于沸水中加熱5 min，冷卻后，各試管用蒸餾水定容至25 mL，試管6作為對照組，其他組平行試驗3次且結果取平均值。③測定試驗菌株在520 nm的吸光度，以麥芽糖量為橫坐標，吸光光度值為縱坐標，得到麥芽糖含量的回歸方程。

（3）酶活力單位定義。在40 ℃、pH值 6.0的條件下，每分鐘從1%的可溶性淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位（U）[9]。

1.2.6 菌落形態觀察

將初篩后的菌株平板劃線，純化，在28 ℃恒溫培養箱中培養3 d，用美藍與棉藍溶液分別對酵母菌與霉菌進行鏡檢。觀察平板中菌落的顏色、大小、表面的粗糙程度、鏡檢下的孢子形態以及菌株菌絲狀態等，并且參照《真菌鑒定手冊》[10]進行比較。

1.2.7 菌株生物學特性測定

（1）溫度對菌株產淀粉酶能力的影響。將待測菌株接種于發酵培養基中，分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃ 5個溫度下培養，180 r/min條件下振蕩培養2 d，取2 mL酶液進行酶活性測定。每組設3個平行樣，每個樣品重復3次，結果取平均值[11]。

（2）酒精濃度對菌株產淀粉酶能力的影響。以5%的菌液種量接種到酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養基中，在28 ℃，180 r/min條件下振蕩培養2～3 d，取2 mL酶液進行酶活性測定。每組設3個平行樣，每個樣品重復3次，結果取平均值。

（3）酸堿度對菌株產淀粉酶的影響。以5%的菌液接種量接種到pH值 2.5、pH值 3.0、pH值 3.5、pH值 4.0和pH值 4.5的高粱汁培養基中，在28 ℃，180 r/min條件下振蕩培養2～3 d，取2 mL酶液進行酶活性測定。每組設3個平行樣，每個樣品重復3次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 耐酸、高產淀粉酶菌株的篩選結果

2.1.1 淀粉酶標準曲線繪制

淀粉酶標準曲線見圖1，該方程為y=0.268 9x+0.0565 5，R2=0.991 9。

2.1.2 高產淀粉酶菌株的篩選

從大曲中初篩分離得13株菌株，根據培養基的顏色與菌落形態，初步觀察判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉，因黃曲霉會產生黃曲霉毒素，其是一類有毒的次生代謝產物，且廣泛存在于農作物及食物中，被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為“Ⅰ”類致癌物，故復篩時將黃曲霉剔除，選取酵母菌、毛霉與青霉中透明圈直徑與菌落直徑較大的3株菌株進行復篩，測定其酶活性[12]。由表1可知，WB4與WB9的酶活性最高，說明這兩株菌株的產酶能力較好。

2.1.3 耐酸淀粉酶的篩選

將WB4與WB9分別接種于pH為2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的YEPD培養基中恒溫培養3 d。由表2可知，在波長560 nm下，且pH在2.5～4.5，隨著pH的變化，WB4與WB9的OD值至均高于前一梯度的OD值。傳統釀酒工藝中，在糖化之前需將醪液pH值由6.5降到4.5，以便糖化酶活性的最大化。因pH在4.5的條件下，WB4的酶活性更高，故WB4即為所要篩選耐酸、高產淀粉酶微生物。耐酸性以及酶活結果如表2所示。

2.2 產淀粉酶菌株形態學鑒定

從初選培養基中分離出3種不同形態的菌株，再進行純化，觀察菌落形態與孢子特征，如圖2所示。由圖2可知，在28 ℃條件下，將菌株WB4、WB9、WB13培養3 d，其中WB4與WB13菌落呈乳白色，表面呈圓形且凸起，菌落較小，邊緣較為規則，菌落中單個細胞寬度約2～3 nm，長度5～6 nm，呈橢圓形，初步鑒定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。WB9菌落呈雪白色，表面黏稠、濕潤，邊緣不規整，菌落較大，菌落中單個細胞直徑約2～3 nm，呈卵圓狀，初步鑒定為粉狀米勒酵母（Millerozy mafarinose）。實驗菌株形態特征與《真菌鑒定手冊》和文獻[13]鑒定結果一致。

（a）WB9的菌落形態、菌絲形態以及分生孢子形態

（b）WB4的菌落形態、菌絲形態以及分生孢子形態

（c）WB13的菌落形態、菌絲形態以及分生孢子形態

圖片從左至右依次為菌落形態、菌絲形態（×100）及分生孢子（×400）形態圖。

2.3 菌株培養條件優化

2.3.1 溫度對菌株WB4產淀粉酶能力的影響

將菌株分別在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃與

40 ℃ 5個溫度下培養2 d后，用DNS法測定其酶活性，結果如圖3所示。由圖3可知，菌株WB4在32 ℃時，酶活性最高，平均OD值為2.877;當溫度低于32 ℃時，菌株的酶活性相較之下較低;當溫度高于32 ℃時，酶活性顯著降低。因此，確定菌株WB4的最適溫度為32 ℃。

2.3.2 酒精濃度對菌株WB4產淀粉酶能力的影響

將WB4的種子液加入含有100 mL的酒精濃度為2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培養基的錐形瓶中，貼好標簽，置于28 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d后，用DNS法測定其酶活性，結果如圖4所示。由圖4可知，當酒精濃度在2%～8%時，WB4菌的OD值是緩慢下降，但酒精濃度在8%～10%時，WB4的OD值下降較快。因此，WB4菌株的耐酒精濃度為10%。

3 結論

本研究從湖南省湘窖酒業有限公司中高溫包包曲中篩選出13株產淀粉酶的菌株，并對這13株菌株進行初步的形態學觀察，判定為酵母菌、毛霉、青霉與黃曲霉4種菌株，因為黃曲霉會產生黃曲霉毒素，故不進行后續操作;其他菌株通過酶活性大小鑒定，得WB4與WB9這兩株菌株的產淀粉酶能力較強;將WB4與WB9這兩株菌株接種于YPED液體培養基中，再通過DNS法對其進行酶活性大小比較，最終獲得一株耐酸、高產淀粉酶菌株WB4;經過形態學觀察，鑒定該菌株為釀酒酵母;通過液體發酵法確定該菌株產酶的最佳條件為：溫度為32 ℃，酒精濃度為10%。本試驗通過篩選耐酸性和高產性的釀酒微生物，有效解決了釀酒糖化過程前的酸堿調節問題，減少釀酒過程中不必要的環節，節約了時間，能夠有效提高工業生產的產酒率，降低釀酒生產成本。

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基金項目：湖南省大學生創新創業訓練計劃項目（湘教通〔2020〕191號-3406）;國家級大學生創新訓練項目（S202010547049）。

作者簡介：陳闊（2001—），男，湖南長沙人，本科在讀。研究方向：微生物。

通信作者：尹樂斌（1982—），男，江西樂安人，博士，副教授。研究方向：果蔬加工。E-mail：112608803@qq.com。