秋水仙素誘導“法新”藍莓多倍體初探

崇慧影 安常蓉 王代波 文光琴 趙亮清

摘 要 為建立秋水仙素誘導藍莓多倍體的方法，以“法新”藍莓組培苗為試驗材料，用濃度為0.1%、0.2%、0.4%的秋水仙素溶液分別浸泡藍莓組培苗莖段10 h、18 h、26 h，培養45 d后觀察和測定無菌藍莓組培苗生長狀況及相關生理指標。結果初步表明：在同一處理時間條件下，藍莓組培苗成活率隨著秋水仙素濃度的增加而降低;在同一處理濃度條件下，藍莓組培苗成活率隨秋水仙素處理時間的增加而降低。與對照相比，變異植株出現莖段增粗、葉面積變大和葉片顏色加深等特征。結合隸屬函數對其綜合分析表明，秋水仙素濃度為0.2%處理10 h是最適合“法新”藍莓組培苗多倍體的誘導條件。

關鍵詞 藍莓;秋水仙素;誘導多倍體;隸屬函數

中圖分類號：S663.9 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.11.017

藍莓（Vaccinium uliginosum）為杜鵑花科越橘屬植物，又名藍漿果，是一種多年生灌木，其果實富含多種維生素、微量元素及花色素苷、類黃酮等生理活性成分，這些化合物對人體有多種益處，如清除體內多余自由基、提高免疫力、抵抗身體和皮膚的氧化衰老等[1]。藍莓作為果中珍品，因保健及藥用價值較高，已被聯合國糧食及農業組織列為人類五大健康食品之一[2]。目前，我國具有較豐富的野生藍莓資源，但野生品種產量低且品質差，而多倍體藍莓不僅枝繁葉茂、抗性強，而且果實品質好、果大、產量高，為選育優質新品種提供了重要途徑，對開發利用及保存我國藍莓種質資源具有重大意義[3]。

與普通的二倍體植物相比，多倍體植物在遺傳可塑性及生理適應性等方面具有更強的優勢，因此越來越多的植物學家熱衷于探究多倍體的選育工作。隨著生物技術的高速發展及科學研究的不斷深入，植物多倍體誘導也愈發得到廣泛的應用及發展[4]。誘導多倍體通常采用3種方法，即生物學方法、物理方法及化學方法，最常用的方法是采用化學誘變劑進行誘導，這也是當前最有效、最經濟的方式[5]。在多倍體誘導過程中，通常選取植物體內生長最活躍、最旺盛的組織器官進行誘導，如植株的愈傷組織、萌動或剛出芽的種子幼苗、幼嫩枝條的生長點等，采用吲哚乙酸、秋水仙素等化學誘變劑對其進行處理，均可誘導形成多倍體，該方法最大的優勢就是具有高度專一性[6]。在所有的誘變劑中，秋水仙素處理誘變效果最佳。用秋水仙素處理細胞后，由于紡錘絲不能形成而停留在有絲分裂中期階段，每一個染色體形成的一對染色單體分離，但由于缺少紡錘絲的牽引而不能向兩極移動，無法形成兩個單獨的子細胞，最終導致染色體加倍[7]。有學者使用秋水仙素對蘋果組培苗幼葉片進行誘導，同時增添了濃度為2%的二甲基亞砜，結果發現，使用濃度為0.5%的秋水仙素對其處理4 d后，有56.1%的植株被誘導成多倍體[8]。利用組織培養技術與秋水仙素誘導多倍體相結合的技術選育新品種，比常規雜交育種周期短，不受季節變化的影響，能較快繁育出藍莓多倍體新品種，不僅提高了藍莓果實品質，還推動了藍莓工廠化育苗。

因此，本試驗以“法新”藍莓組培苗為研究對象，通過觀察植株的生長特征及測定植株的各項生理指標，探究不同濃度秋水仙素和不同浸泡時間對藍莓組培苗的影響，以期篩選出藍莓多倍體誘導的最佳處理濃度和時間。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

試驗材料為“法新”藍莓組培苗。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 多倍體誘導

選取生長健壯的藍莓無菌組培苗，剪取長度約1 cm的莖段。選取生長一致的莖段浸泡在3種不同濃度（0.1%、0.2%、0.4%）的秋水仙素溶液中，浸泡時間分別為10 h、18 h、26 h，共9個處理，每個處理30個莖段;將秋水仙素浸泡過的莖段置于搖床（120 r·min-1）振蕩，處理溫度為（26±1） ℃;將處理好的莖段接種于改良的WPM培養基上，每個處理接種6瓶，每瓶接種5個莖段。同時在改良的WPM培養基上接種未經秋水仙素處理的莖段作為對照。

培養條件：改良WPM培養基的pH值為5.6，培養室相對濕度為（75±5）%，溫度為（25±1） ℃，光照周期為12 h·d-1，光照強度為1 800～2 500 lx，各處理因素水平組合列于表1。

1.2.2? 測量指標及方法

1）生長指標。繼代培養45 d后，根據形態觀察法確定成活植株和變異植株，統計不同處理的成活數和變異數，計算成活率和變異率，計算公式為[9]：

成活率=成活株數/總處理株數×100%

變異率=變異株數/總處理株數×100%

2）形態指標。對藍莓植株的株高、葉長、葉寬、葉片數、莖粗、鮮質量和增殖數進行測定，數據以[x±s]表示。

3）綜合性評價。采用SPSS軟件計算半致死時間（LT50），采用隸屬函數法對其綜合性評價[9-10]。

2? 結果與分析

2.1? 秋水仙素對藍莓組培苗生長指標的影響

2.1.1? 成活率

由表2可知，藍莓組培苗的成活率受到秋水仙素濃度和處理時間的雙重影響。對照組藍莓組培苗成活率最高，達100%;秋水仙素濃度一致時，各處理間成活率大小排序為A1>A2>A3，B1>B2>B3，C1>C2>C3，表明藍莓組培苗的成活率隨著秋水仙素處理時間的增加而減小;秋水仙素作用時間相同時，成活率大小排序為A1>B1>C1，A2>B2>C2，A3>B3>C3，表明秋水仙素處理濃度越高，藍莓苗成活率越低。

2.1.2? 變異率

由表2可知，藍莓苗變異率排序為B1>B2>C3>B3>A2>A3>C1>C2>A1，B1處理和B2處理的變異率分別為35.7%和29.6%。當秋水仙素處理濃度為0.1%時，隨著處理時間的增加，變異率變化趨勢為先升后降，最高達21.4%;濃度為0.2%時，隨著處理時間延長，變異率逐漸降低，最高為35.7%;濃度為0.4%時，隨著處理時間的延長，變異率先降后升，最高為25.0%。在處理時間為10 h、18 h時，隨著處理濃度的增加，變異率呈現先增大后減小趨勢;在處理時間為26 h時，變異率隨濃度的增加而增大。

2.2? 秋水仙素對藍莓組培苗形態指標的影響

由表3可知，不同秋水仙素處理下藍莓組培苗形態指標差異顯著。1）株高排序為A3>C2>A1>B1>C3>CK>B3>C1>B2>A2，A3處理平均株高最高，為47.84 mm，比對照高4.49 mm;A1、B1、C2、C3與A3處理間差異不顯著（P>0.05），A2、B2、B3、C1、CK與A3處理間差異顯著（P<0.05）。2）葉長排序為C1>A3>B1>C2>B3>C3>A1>A2>B2>CK，C1處理葉長最長，為10.40 mm，比對照長2.48 mm;A3、B1、B3、C2與C1處理間差異不顯著（P>0.05），A1、A2、B2、C3、CK與C1處理間差異顯著（P<0.05），B2、CK處理葉長最短，且二者間差異不顯著（P>0.05）。3）C1處理葉寬值最大（6.20 mm），CK葉寬值最小（4.06 mm），兩者相差2.14 mm;各處理葉寬排序為C1>B1>A2>B3>A3>C3>C2>B2>A1>CK，但C1與B1處理間差異不顯著（P>0.05）。4）葉片數最多的為A1（14.65片），各處理具體排序為A1>A3>C2>C3=B2>CK>B1>B3>A2>C1，但A3、B2、C2、C3、CK與A1處理間差異不顯著（P>0.05）。5）A3處理莖段最粗（1.08 mm），CK莖段最細（0.71 mm），兩者相差0.37 mm;各莖段粗度排序為A3>A2>B3>C1>C2>A1>B2>C3>B1>CK，但A3與A2、B3、C1處理間差異不顯著（P>0.05）。6）A2處理鮮質量最大，為0.53 g，各處理鮮質量排序為A2>C2>B2>C1>C3>B3>A3=B1=CK>A1，其中B2、C1、C2與A2處理差異不顯著（P>0.05）。7）CK處理增殖數最多，為6.8個，其次為B2處理，增殖數為4.93個，二者差異顯著（P<0.05）;各處理增殖數排序為CK>B2>A1>A2>C1>A3>B1>C3>B3>C2。

2.3? 秋水仙素對藍莓組培苗各指標隸屬度、綜合值及半致死時間的影響

由表4可以看出，通過隸屬函數對藍莓組培苗葉長、葉寬、莖粗、存活率及變異率5項指標綜合分析發現，效果最好的為B1處理，即0.2%濃度的秋水仙素浸泡10 h時，“法新”藍莓植株的變異效果達到最好。

對表2中秋水仙素濃度0.2%時處理組數據進行半致死時間方程的擬合，將該濃度下的處理時間及相應的死亡率代入計算得出線性回歸方程為y=0.625x-0.116 7，R2=0.962 9。經計算，藍莓植株在秋水仙素濃度為0.2%時的半致死時間為80.19 h，說明秋水仙素溶液對“法新”藍莓植株毒性較弱。

3? 小結與討論

秋水仙素誘導在多倍體育種中應用廣泛且效果明顯[11]。本試驗中，“法新”藍莓在0.2%秋水仙素溶液中處理10 h時，植株死亡率6.7%，變異率35.7%，誘導效果最佳。

有研究表明，處理材料的死亡率與秋水仙素濃度和處理時間成正比關系[1]。本試驗表明，同一處理濃度下，植株的死亡率隨著秋水仙素處理時間的延長而增大;同一處理時間下，植株的死亡率隨著秋水仙素濃度的增高而增大，與前人研究結果趨勢一致[12]。

秋水仙素對植株毒性的大小常用半致死時間（LT50）作為參數，在EMA誘導小麥突變的研究中，半致死時間篩選適宜的處理條件有重要的指導作用[13]。本試驗發現，0.2%濃度的秋水仙素對“法新”藍莓植株的毒性較弱，該結果與前人針對越橘屬植物的研究結果不一致，推測可能與植物品種有關，具體原因有待進一步研究。

有研究發現，對黃心獼猴桃進行多倍體誘導時出現葉片顏色加深、葉片增厚的現象;誘導黃瓜獲得四倍體時，植株出現莖段明顯增粗等特征[14-15]。本試驗中，經秋水仙素處理后的藍莓組培苗在生長過程中出現葉片顏色變深、葉表皮毛增多、葉面積顯著增大、莖段明顯增粗及增殖系數減小等現象，各項形態指標與對照差異均具有統計學意義。下一步將對獲得的多倍體植株煉苗移栽，觀察其田間性狀表現。

參考文獻：

[1] 李雪松，趙康，李凌.越橘“Legacy”離體培養及秋水仙素誘變研究初報[J].西南大學學報（自然科學版），2015，37（5）：51-57.

[2] 周繼芬，蘭武，王軍，等.藍莓營養及獨特保健功能研究[J].北方園藝，2020（21）：138-145.

[3] 裴新澍.植物多倍體育種[J].中國農業科學，1962（12）：6-12.

[4] 韋榮昌，吳慶華，馬小軍，等.植物多倍體的研究進展[J].種子，2013，32（7）：50-52.

[5] 周璐璐.沙蘆草染色體加倍技術及再生體系建立研究[D].銀川：寧夏大學，2016.

[6] 張愛清.人工誘導植物多倍體的方法初探[J].中學生物學，2016，32（4）：5-6.

[7] 劉圣明.灰葡萄孢菌抗多菌靈β-微管蛋白基因在禾谷鐮孢菌中的表達研究[D].南京：南京農業大學，2011.

[8] 王長泉，李雅志，崔德才，等.蘋果葉片離體培養中秋水仙素加倍效應的研究[J].核農學報，1997（1）：23-27.

[9] 李映樂，張伊，李茹，等.秋水仙素誘導人參果“圓果”多倍體的初探[J].江蘇農業科學，2021，49（10）：122-126.

[10] 馮琛，黃學旺，李興亮，等.不同蘋果矮化砧穗組合的抗旱性比較研究[J].園藝學報，2022，49 （5）：945-957.

[11] Hisato K， Toshiki N， Kinya M， et al. Somaclonal and chromosomal effects of genotype， ploidy and culture duration in Asparagus officinalis L.[J]. Euphytica， 1998， 102（3）： 309-316.

[12] 楊佩.花魔芋多倍體誘導技術研究[D].荊州：長江大學，2013.

[13] 閆炯，付晶，劉桂茹，等.EMS誘變小麥河農822的SSR及SDS-PAGE鑒定[J].河北農業大學學報，2008（1）：1-5.

[14] 魏卓，張先昂，張越，等.黃心中華獼猴桃多倍體誘導及鑒定[J].分子植物育種，2020，18（12）：

4036-4040.

[15] 武婭歌，趙建華，宋曉飛，等.歐洲溫室型黃瓜同源四倍體新種質的創制與鑒定[J].江蘇農業科學，2019，47（18）：141-145.

收稿日期：2022-03-11

基金項目：貴州省生物研究所基金項目“水肥調控對藍莓生長發育及果實品質的影響”（黔生所字〔2021〕02號）;貴州科學院青年基金項目“藍莓菌根形成調控因素及接種效應的研究”（黔科院J字〔2021〕15號）;貴州省科技計劃項目“貴州不同海拔地區高叢類食鮮藍莓良種鑒選及配套栽培技術研究”（黔科合支撐〔2021〕一般232）。

作者簡介：崇慧影（1992—），女，安徽阜陽人，碩士，研究實習員，研究方向為作物栽培育種。

*為通信作者，E-mail：875004614@qq.com。