烏雞腸道中一株乳酸菌的分離鑒定及生物學特性研究

付 祥， 劉曉娜， 劉瑞雪， 蘇建青， 褚秀玲

（聊城大學農學院，山東聊城 252000）

長期使用抗生素所帶來的食品安全問題、生態環境問題等正在顯現（尹珺伊等，2021）。根據中華人民共和國農業農村部第194 號公告的要求（中華人民共和國農業農村部，2019），全面停止生產和使用除中藥外的所有促進生長類的藥物飼料添加劑。 因此，選擇一種綠色、健康的飼料添加劑是現在畜牧業的重點方向。

乳酸菌是目前益生菌研究和應用的重點對象之一，研究認為，乳酸菌作為畜禽腸道內重要的一種益生菌，不僅直接影響畜禽的健康和生長，還對畜禽的自身免疫系統穩態發展起到重要的協助保護作用（王天威等，2020）；其通過產乳酸菌素以及多種有機酸來改善機體腸道菌群 （Wu 等，2019；匡珍等，2019）； 通過產酸以及附著于宿主腸道細胞的方式， 來抑制抑制動物消化道中諸如沙門氏菌、 大腸桿菌、 葡萄球菌等有害菌群的定植（Yousef Nami 等，2018；Nejati 等，2016；謝璐娜等，2016）； 還可以降低炎癥反應 （Shilan Wang 等，2019）以及清除氧自由基，抑制細胞產生活性氧，發揮其抗氧化（賀騰飛等，2019）的作用。 因此，篩選出具有良好性能的乳酸菌菌株具有重要意義（王文梅等，2013）。

本試驗以烏雞腸道微生物菌群為試驗研究的樣本， 使用腸道微生物的試驗方法 （何江波等，2021），從健康烏雞的腸道中，篩選出性能良好的乳酸菌（劉小蘭等，2020），并研究所選菌株N 的生物學特性以及抑菌性能（張磊等，2021），為分離的乳酸菌菌株N 應用于微生態制劑以及飼料添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 烏雞糞便來自30 周齡的健康烏雞。試驗所需液體以及固體培養基、革蘭氏染色以及生化試驗所需試劑均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。 病原菌由聊城大學實驗室分離保存。 藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 相關試驗用品購自上海生工生物工程股份有限公司。

UV-5900 紫外可見分光光度計， 上海元析儀器有限公司；電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京市六一生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 健康烏雞的糞便用無菌生理鹽水稀釋后， 使用滅菌紗布過濾除去烏雞腸道中的剩余內容物（楊逢清等，2020）。使用無菌生理鹽水稀釋濾液，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次進行梯度稀釋，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 分離純化 使用一次性注射器抽取稀釋的糞便濾液，將其加入滅菌完畢的MRS 肉湯培養基中，37 ℃增菌培養24 h， 增菌完成后將菌液梯度稀釋至10-7，移液器吸取梯度稀釋至10-5～10-7的菌液各100 μL， 均勻涂布在加入了2%碳酸鈣的選擇培養基上（尹樂斌等，2016），平板在37 ℃培養24 h。 用接種環在選擇培養基上挑取含有溶鈣圈的單菌落，使用平板劃線法在MRS 瓊脂培養基上進行劃線純化， 直至出現革蘭氏染色為陽性的菌株。 從平板中挑取單個菌落， 將單株細菌純化增菌培養，用體積分數50%甘油保存純化增菌后的菌株，并將其放于-80 ℃超低溫冰箱中，以上工作均在超凈工作臺中進行。

1.2.3 革蘭氏染色和生化鑒定 用接種環取單菌落涂布于滴加生理鹽水的干凈載玻片上， 通過革蘭氏染色進行初步鑒定； 染色完畢后對菌株形態特征進行觀察記錄； 用接種環蘸取一環菌液涂于干凈載玻片上，進行過氧化氫酶試驗，無氣泡產生則為陰性； 再進行10 種糖醇類發酵產酸試驗，進行進一步的驗證。

1.2.4 16S rDNA 鑒定 用煮沸法提取純化后菌株N 的基因組DNA，使用細菌16S rDNA 通用引物27F 和1492R 擴增目的基因片段 （上游引物：27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTGAG-3； 下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。以基因組DNA 為模板， 進行菌株N 的16S rDNA PCR 擴增。PCR 反應體系（25 μL）：Premix 13 μL，ddH2O 8 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 2 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；54 ℃退火45 s；72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min。 PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析儀觀察結果。

將純化的菌株， 挑選出平板劃線法單菌落多的一次性平皿，送往青島測序公司進行測序，將菌株N 的測序結果在NCBI 網站上進行同源性比較。下載同源性最高的模式菌株核苷酸序列，利用MEGA 7.0 軟件構建菌株N 的系統進化樹。

1.2.5 生物學特性研究

1.2.5.1 菌株生長曲線測定 取菌株24 h 發酵液，以2%接種量接種MRS 肉湯，37 ℃培養。 間隔2 h 取樣一次，使用滅菌MRS 肉湯為空白對照，在波長600 nm 處檢測菌株N 發酵液OD600nm值。 以培養時間為橫坐標， 測定的OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的生長曲線圖。

1.2.5.2 菌株產酸曲線測定 取菌株N 的24 h發酵液，按照2%接種量，將其接種至滅菌MRS 肉湯，37 ℃培養。 每隔6 h 取樣，測定不同培養時間菌株發酵液pH。以培養時間為橫坐標，測定的pH為縱坐標，制作菌株N 的產酸曲線圖。

1.2.5.3 菌株的耐酸、 耐膽堿能力 配制pH 為2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 的MRS 肉 湯 培 養 基，在121.6 ℃條件下滅菌15 min。 取菌株N 的24 h 發酵液，以2%接種量接種MRS 肉湯，于37 ℃培養24 h， 使用無菌MRS 肉湯為空白對照。 在波長OD600nm處取樣， 測定培養基pH 不同時菌株N 發酵液的OD600nm值。 以pH 為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的耐酸能力曲線圖。

配制濃度條件為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%的牛膽酸鈉， 將其順序加入至MRS 肉湯培養基中，在121.6 ℃條件下滅菌15 min。 取菌株N 的24 h 發酵液，以2%接種量接種，于37 ℃培養24 h，使用無菌MRS 肉湯為空白對照。于波長600 nm 處測定膽鹽濃度不同時菌株發酵液的OD600nm值。以膽鹽濃度為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，制作菌株N 的耐膽堿能力曲線圖。

1.2.6 抑菌試驗 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌分別接種于普通肉湯培養基，37 ℃培養24 h； 將菌株N 按照2%接種量接種至MRS 肉湯當中，37 ℃培養24 h，調節發酵液菌體濃度為1×108cfu/mL。取致病菌的菌液100 μL 均勻涂布于麥康凱以及營養瓊脂平板上，滴加50 μL 菌株N 的菌液，4 ℃放置12 h 后，將以上平板放于37 ℃培養24 h，測量菌株N 對病原菌的抑菌圈直徑。

1.2.7 藥敏試驗 試驗測定分離菌株N 的藥物敏感性，將菌株N 按照2%接種量接種至MRS 肉湯當中，37 ℃培養24 h。 均勻涂布100 μL 菌株N的菌液于MRS 瓊脂培養基上，用無菌鑷子夾取藥敏片，將其放置于培養基表面壓緊，將培養基置于37 ℃培養24 h，根據產生的抑菌圈大小評定菌株N 的藥物敏感性（李肖等，2017）。

2 結果

2.1 菌落形態及鏡檢結果 培養24 h，觀察到菌株N 的菌落凸起，白色，邊緣整齊（圖1）；在MRS 培養基中加入2%碳酸鈣， 菌株N 菌落周圍產生融鈣圈（圖2）；對菌株N 染色后進行鏡檢，結果如圖3 所示， 菌株N 的形態呈現桿菌， 兩端圓， 成短鏈。

圖1 分離菌菌落形態

圖2 分離菌產生的融鈣圈

圖3 分離菌染色鏡檢圖

2.2 生化鑒定結果 由表1 可知， 菌株N 生化鑒定結果與乳桿菌基本相符。

表1 菌株N 生化鑒定結果

2.3 16S rDNA 鑒定結果 通過煮沸法提取菌株N 的基因組DNA，對菌株N 進行PCR 擴增，得到片段約為1500 bp 的特異性條帶（圖4），與預計得到的條帶大小相符。 測序后得到的菌株N 序列在NCBI 比對結果顯示，菌株N 和戊糖乳桿菌的相似度達100%。 利用MEGA 7.0 軟件繪制得系統發育樹（圖5）。

圖4 分離菌電泳結果

圖5 菌株N 的16S rDNA 基因系統發育進化樹

2.4 生物學特性研究

2.4.1 生長曲線以及產酸試驗結果 由圖6 可見，0 ～6 h 菌株N 處于遲緩期，6 ～18 h 菌株N 處于對數期，18 h 后趨于穩定。 菌株N 能夠較快到達對數期，生長特性良好。由圖7 可見，0 ～6 h 菌株N 發酵液的pH 下降較慢，6 ～18 h 菌株N 發酵液的pH下降速度較快，18 h 后pH 趨于穩定。 數據顯示，菌株N 菌液的pH 下降幅度符合菌株生長曲線增幅，pH 降低25%。結果表明菌株N 在增殖過程中產酸，其可通過降低發酵液的pH 來抑制雜菌生長。

圖6 乳酸菌N 生長曲線圖

圖7 乳酸菌N 產酸曲線

2.4.2 不同pH 條件對菌株N 存活數的影響 由圖8 可見，pH 為6 時，菌株N 的OD600nm值為3，隨著MRS 肉湯pH 的減小，其OD600nm值逐漸降低，在pH 為2 ～3 時，菌株N 的OD600nm值較小，說明菌株N 具有一定的耐酸性。

圖8 乳酸菌N 在不同pH 下的OD 值

2.4.3 不同膽鹽條件對菌株N 存活數的影響由圖9 可見，膽鹽均能抑制菌株N 的生長，菌株N 的OD600nm值與膽鹽濃度呈相反的趨勢，即菌株N 的OD600nm值隨著膽鹽濃度的不斷升高而下降，但是菌株N 在高濃度的膽鹽中，OD 值仍在2 以上，表明其仍然有較高的活性，因此菌株N 具有一定的耐膽鹽特性。

圖9 乳酸菌N 在不同濃度膽鹽下的OD 值

2.4.4 抑菌試驗結果 由圖10、圖11 可知，菌株N 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種病原菌均有良好抑菌性，抑菌圈直徑分別約為35、30 mm。

圖10 乳酸菌N 對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

圖11 乳酸菌N 對大腸桿菌的抑菌效果

2.4.5 藥敏試驗結果 根據微生物敏感性執行標準對藥物敏感性進行區分， 并將藥物敏感性分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。 由表2 可知，菌株N對乙酰螺旋霉素等高度敏感，對環丙沙星等耐藥。

表2 分離菌藥敏試驗結果

3 討論

作為動物腸道中常見的細菌， 乳酸菌與動物機體的健康有著密切的聯系 （Pokorná Alexandra等，2019）。 乳酸菌作為一種益生菌具有提高飼料利用率（秦紅等，2017）、改善動物消化道功能（張彩鳳等，2017）、促進機體發育（周凌博等，2019）、提高免疫力（孔雨昕等，2021）等益生功能。在畜牧生產中， 用來制作飼料添加劑以及微生態制劑的菌株主要從動物和人類的消化道、 土壤以及發酵食物中分離， 而不同動物體內的乳酸菌對于腸道的黏附力也不相同（Paula Carasi 等，2013），因此篩選出抗逆性好的同源乳酸菌菌株， 對于畜牧業具有重要的意義。

乳酸菌發揮其益生作用的前提是能夠定植于家畜腸道，并能夠大量增殖，其通過產生有機酸和抗菌活性肽等物質阻遏致病菌群的定植（廖波等，2019；李潔等，2014），調控腸道細胞免疫功能來促進動物機體健康， 因此菌株達到對數期的時間越短，越能夠發揮其良好的益生作用。通過測定并制作本試驗分離菌株N 的生長曲線，發現菌株N 進入對數期較快，符合篩選菌株的要求。乳酸菌作為外來添加的菌株， 需要經過消化道的低pH 環境后，仍然有著較好的活性，能夠進行生長繁殖，因此需要篩選耐酸、耐膽堿的菌株。本試驗分離的菌株N 對于腸道環境有著較好的耐受性，可用于制作益生菌添加。

綜上所述， 本試驗從烏雞腸道中分離鑒定到的菌株N 為戊糖乳桿菌，作為同源菌株更有利于在雞腸道內定植， 菌株N 在8 h 左右即可到達對數期，說明其生長特性優良。而且菌株N 在pH 為4、膽鹽濃度為0.3%時，仍有良好的生長性能，說明其耐酸、耐膽鹽性能好，表明菌株N 適合作為飼料添加劑的優良菌種。