添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣全混合日糧發酵品質及有氧穩定性的影響

高巧仙， 朱萬清， 李曉梅， 洪曉珍， 馬潤生， 脫征軍， 辛國省

（1.寧夏大學生命科學學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏飼料工程技術研究中心，寧夏銀川 750021；3.寧夏回族自治區畜牧工作站，寧夏銀川 750002）

寧夏釀酒葡萄種植面積達55 萬畝， 占全國的1/4，年產葡萄酒近1.3 億瓶，綜合產值超過261 億元。 葡萄酒釀造過程中，產生的葡萄皮渣約占葡萄加工量的20%～30%。 釀酒葡萄渣營養價值高，富含天然抗氧化劑（Yu 等，2013），可作為優質的粗飼料。但其水分含量高，難以長期保存，同時寧夏葡萄渣加工利用率低， 多數葡萄渣被拋棄或是直接飼喂。 受纖維素和單寧含量的影響，直接飼喂反芻動物不易消化，造成資源利用率不高和浪費嚴重。

酶和菌的使用是改善青貯飼料品質常用的方法， 合理地搭配使用能更好的的促進飼料原料發酵，從而提升飼料的品質和利用效果。纖維素酶能分解飼料中的纖維素、半纖維素和木質素，并能降解結構性糖類成為乳酸菌可利用的可溶性糖，增加乳酸的發酵底物，加速降低pH，提高青貯發酵品質 （李春霞，2010）。 布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）屬異型發酵菌，能有效保存青貯飼料和提高其有氧穩定性（Kleinschmit，2006）。 目前對布氏乳桿菌和纖維素酶聯合使用效果評價研究較少（劉輝等，2021）。 因此， 為合理利用釀酒葡萄渣資源，擴大飼料來源，克服釀酒葡萄渣季節性的時間

點，改善葡萄渣發酵全混合日糧品質，本試驗研究添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣發酵全混合日糧發酵品質及有氧穩定性的影響，以期為生產優質的反芻動物葡萄渣發酵全混合日糧提供一定的理論依據和技術支撐，促進寧夏畜牧業更好發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 釀酒葡萄渣購于寧夏西鴿酒莊有限公司，晾干粉碎添加，營養成分見表1；玉米秸稈由寧夏賀蘭縣祥鑫泰養殖合作社提供； 添加纖維素酶購于山東坤盛藥業有限公司， 布氏乳桿菌購于西安米先爾生物科技有限公司， 活菌數為1.0×109cfu/mL。

表1 葡萄渣營養成分（風干基礎）

1.2 FTMR 制備 采用完全隨機單因素試驗設計，在保持飼糧精粗比約為6：4（干物質基礎）的前提下，釀酒葡萄渣添加水平為8%，配方按照25 kg育肥羊飼養標準配制。將不添加菌劑的對照組，纖維素酶按50、100 mg/kg，布氏乳桿菌按10、30 mg/kg，纖維素酶和布氏乳桿菌混合50×10 mg/kg、100×30 mg/kg 的添加量（添加量以全混合日糧（TMR）鮮重為基礎， 接種方法是將每組所需菌粉和纖維素酶溶解至100 mL 無菌水中， 邊用噴壺均勻噴灑邊翻動青貯料）加入到預先混勻的精料中，分組裝好待配TMR，TMR 組成及營養水平見表2。 將玉米秸稈揉切成2 ～3 cm， 按照試驗設計將精料和粗料添加到TMR 攪拌車中混勻，通過添加適量水使攪拌均勻的TMR 含水率達到62%。 用“四分法”取制作好的TMR，裝入1.5 L 發酵瓶中，壓實密封存放在室內干燥地面上， 每個處理制備10瓶，每瓶凈重1.5 kg。

表2 TMR 組成及營養水平%

1.3 樣品采集 在TMR 飼料在發酵后的第45天打開發酵瓶，先對青貯飼料樣品進行感官評定，然后按照4 分法采集樣品。 取500 g 樣品在105 ℃烘干測定水分，并粉碎過40 目篩，保存于封口塑料袋中，待測常規營養含量；取25 g 樣品加100 mL蒸餾水， 榨汁機攪拌搗碎后用4 層紗布和定性濾紙過濾得浸出液， 所得浸出液一部分用于pH 測定，另一部分-20 ℃保存，用于發酵品質的測定；最后取500 g 樣品用于測定有氧穩定性。

1.4 指標測定及方法

1.4.1 感官評定 采用德國農業協會標準進行評價（張子儀，2000）。 青貯結束后，根據青貯飼料的氣味、結構、色澤和發霉情況進行評價打分。 滿分為20 分，16 ～20 分為一級優良，10 ～15 分為二級尚好，5 ～9 分為三級中等，0 ～4 分為四級腐敗。

1.4.2 常規營養含量的測定 粗蛋白質含量參照GB/T 6432-1994， 粗灰分含量參照GB/T 6438-2007，中性洗滌纖維含量參照GB/T 20806-2006，酸性洗滌纖維含量參照NY/T 1459-2007，酸性洗滌木質素含量參照GB/T 20805-2006 測定。

1.4.3 發酵參數的測定 用pH 計測定濾液的pH； 氨態氮含量采用苯酚次氯酸鈉比色法測定（馮宗慈等，2010）； 乳酸含量參照國標 GB/T 28377-2009 測定；乙酸、丙酸和丁酸含量參照郝建祥（2011）的方法采用安捷倫7820A 氣相色譜儀進行測定。

1.4.4 有氧穩定性測定 青貯飼料開啟后， 將剩余青貯飼料約500 g 混勻后置入1 L 聚乙烯罐中，插入溫度記錄儀（HOBO Pendant Coupler）探頭，測定青貯飼料溫度和環境溫度，用青貯飼料溫度與環境溫度相差2 ℃時需要的時間來評定青貯飼料的有氧穩定性。

1.5 數據處理 采用Excel 2010 進行數據整理后，利用SPSS 20.0 統計軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗， 多重比較采用one-way ANOVA 中的Duncan’s 法進行統計分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 感官品質的影響 由表3 可知，各組青貯料樣品均結構完整，直至發酵第45 天也未出現丁酸臭味或腐敗味，總分等級在“尚好”以上。與對照組相比，纖維素酶處理組、布氏乳桿菌處理組和纖維素酶與布氏乳桿菌混合處理組的感官評定得分分別提高了21.43%、21.43%和28.57%，說明添加纖維素酶和布氏乳桿菌均能改善FTMR 的氣味、色澤和質地。

表3 不同處理組的葡萄渣FTMR 感官評定

2.2 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 常規營養含量的影響 由表4 可知，添加纖維素酶和布氏乳桿菌對FTMR 的粗蛋白質和中性洗滌纖維影響顯著（P＜0.05）。 Ⅱ組、Ⅳ組和Ⅴ組的粗蛋白質含量顯著高于對照組（P＜0.05），分別提高了4.6%、6.6%、2.9%，但這三組差異不顯著（P＞0.05）。 Ⅱ組的中性洗滌纖維含量顯著低于對照組（P＜0.05），降低了4.92%。 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對FTMR 的酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質素、 粗灰分和有機物含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

表4 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 常規養分含量的影響（干物質基礎）%

2.3 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR發酵品質的影響 由表5 可知，添加纖維素酶和布氏乳桿菌對FTMR 的pH、 乳酸和丙酸影響顯著（P＜0.05）。 添加布氏乳桿菌組、纖維素酶×布氏乳桿菌組的FTMR pH 均低于對照組，其中Ⅴ組的pH最低，為4.33；Ⅵ組次之，為4.34；Ⅳ組為4.39。 添加劑組的乳酸含量顯著高于對照組， 分別提高了15.28%、20.07%、26.82%、22.56%、30.55%和29.31%。其中Ⅴ組最高，Ⅵ組次之。 Ⅵ組丙酸含量顯著低于對照組，降低了26.92%。 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對FTMR 的乙酸沒有顯著影響（P＞0.05）。

表5 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 發酵品質的影響（干物質基礎）

2.4 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 有氧穩定性的影響 添加纖維素酶和布氏乳桿菌可顯著影響FTMR 有氧穩定性 （P＜0.05）。 添加劑組的有氧穩定性均高于對照組，其中Ⅲ組、 Ⅳ組和Ⅴ組有氧穩定時間分別提高了93.09%、122.07%、70.15%，且均在112 h 以上。

圖1 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 有氧穩定性的影響

3 討論

3.1 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 感官品質的影響 感官評分方法簡便易行，結果直觀，被廣泛用于生產實踐。 乳酸菌和纖維素酶能夠提高青貯飼料的感官評分， 降低霉變率（鐘書等，2017；崔彥召，2011；Ranjit 等，2002；Filya，2001；Driehuis 等，2001）。 席興軍等（2003）研究表明，乳酸菌組、纖維素酶組和乳酸菌與纖維素酶共同處理組的玉米秸稈青貯飼料感官評定得分分別比對照組高25%、42%和35%。本試驗研究結果與以上結果一致， 發酵過程中各處理組均能夠較好的保存45 d，均無霉變發生，纖維素酶組、布氏乳桿菌組、 纖維素酶與布氏乳桿菌混合組在色澤，氣味和質地上要優于對照組。

3.2 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 常規營養指標的影響 粗蛋白質是飼料中含氮物質的總稱， 對發酵飼料飼用價值的評判至關重要（崔彥召，2011）。布氏乳桿菌屬于異型發酵乳酸菌，能將水溶性糖和乳酸分解產生乙酸、二氧化碳等。 高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代謝， 但是對于耐酸性能較好的布氏乳桿菌影響不大， 可快速成為青貯中的優勢菌群， 減少發酵期間有害微生物繁殖代謝對營養物質的消耗，最大程度減少FTMR 蛋白質損失（劉輝等，2021）。這也是本試驗中添加布氏乳桿菌FTMR 的粗蛋白質含量高于對照組的原因。 李斌等（2021）、朱妮等（2019）、鐘書等（2017）研究發現， 添加纖維素酶可提高青貯飼料中粗蛋白質含量，本試驗結果與其一致。 本試驗中，添加纖維素酶組FTMR 的粗蛋白質含量顯著高于對照組，且隨著纖維素酶水平增加，FTMR 中粗蛋白質含量也顯著增高， 這是由于纖維素酶可以水解植物的結構性碳水化合物，為青貯發酵提供底物，加快乳酸菌的生長繁殖，從而產生更多有機酸，降低pH，抑制植物酶活性及其他微生物生長， 從而減少蛋白質的消耗。

中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維是反映飼料中纖維質量好壞的重要指標。 本試驗中添加布氏乳桿菌對中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質素沒有顯著影響。 這與呂文龍等（2011）研究結果基本一致。纖維素酶可降解纖維素、半纖維素和木質素等動物不易消化的物質，并能水解細胞壁，釋放內容物，增加乳酸的發酵底物，改善飼草青貯品質（張英等，2013；Al-Ghazzewi 等，2012）。 鐘書等（2017）等研究發現，苜蓿青貯添加纖維素酶可有效降低其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。本試驗中， 添加纖維素酶可顯著降低中性洗滌纖維含量， 而對酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質素含量沒有顯著影響。 這與Sun 等（2009）研究結果一致，這可能與植物種類、生理狀態、纖維素酶組成等多方面影響有關（呂文龍等，2011）。

3.3 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 發酵品質的影響 pH 是評價青貯發酵品質的重要指標之一， 其變化取決于青貯DM、化學成分和青貯周期。 優質青貯飼料pH 通常在4.2 以下，4.8 以上則認為發酵品質較差，4.2 ～4.8 為良好（馬春暉等，2010）。 本試驗中，各添加劑組pH 在4.33 ～4.47，其中布氏乳桿菌組和纖維素酶×布氏乳桿菌組pH 均顯著低于對照組。且隨著布氏乳桿菌量增加，FTMR 的pH 顯著下降。 這與陸永祥等（2020）研究結果一致，添加布什乳桿菌可顯著降低青貯的pH， 從而提高其發酵品質和有氧穩定性。

乳酸和揮發性脂肪酸含量是評價青貯質量好壞的重要指標。 布氏乳桿菌屬于異型發酵乳酸菌，能將水溶性糖和乳酸分解產生乙酸、二氧化碳等，降低乳酸含量，產生更多的乙酸，布氏乳桿菌組和纖維素酶×布氏乳桿菌組均添加了布氏乳桿菌， 將釀酒葡萄渣中自然附帶菌所產乳酸分解轉化為乙酸， 使布氏乳桿菌組和纖維素酶×布氏乳桿菌組的乳酸和乙酸含量高與對照組。 而高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代謝， 但是對于耐酸性能較好的布氏乳桿菌影響不大，可快速成為青貯中的優勢菌群，通過代謝進一步積累青貯中的有機酸， 可在短期內使青貯的pH 下降，縮短青貯從儲存到進入穩定發酵期的時間，減少發酵期間不良代謝產物丙酸的積累，最大程度保存釀酒葡萄渣FTMR 中的各營養成分，提高發酵品質。

3.4 添加纖維素酶和布氏乳桿菌對葡萄渣FTMR 有氧穩定性的影響 有氧穩定性是青貯飼料一個重要的特性， 其決定了青貯飼料暴露在空氣中的質量和安全性。 Nishino 等（2007）和Oude 等（1999）研究表明，布氏乳桿菌能提高青貯飼料有氧穩定性的機理在于將青貯發酵過程中產生的乳酸轉變為乙酸和1，2-丙二醇。 乙酸具有抗真菌的作用， 能夠有效提高青貯飼料暴露于空氣后的有氧穩定性， 本試驗研究與之相符，添加布氏乳桿菌組的乙酸均高于對照組，同時有氧穩定時間也長于對照組。 劉輝等（2021）和呂文龍等（2011）研究發現，布氏乳桿菌可提高青貯玉米秸稈pH 和乙酸含量，提高青貯玉米秸稈的有氧穩定性。 本試驗中，纖維素酶×布氏乳桿菌組的有氧穩定時間低于布氏乳桿菌組，其機理還有待進一步研究。

4 結論

添加纖維素酶和布氏乳桿菌添加劑均能顯著改善FTMR 感官品質和發酵品質。 添加布氏乳桿菌組的有氧穩定性較優，存放時間較長。