魚腸道和南太湖水樣中乳酸菌分離、鑒定及抑菌分析

李艷潔， 張紅芳， 吳酬飛，， 張立欽

（1.湖州師范學院生命科學學院，浙江湖州 313000；2.湖州師范學院，浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室，浙江湖州 313000）

我國是世界水產品養殖大國，根據《2020 中國漁業統計年鑒》顯示，2019 年我國水產品總產量達6480.36 萬t，其中養殖產量5079.07 萬t，淡水產品產量3197.87 萬t。 在集約化養殖模式下，高密度養殖增加了水產品產量， 隨之也導致養殖水體污染，生態環境破壞，水生動物疾病頻頻出現（楊耿介等，2021）。 由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的細菌性敗血癥，是危害魚的種類最多、范圍最大、流行地區最廣、流行季節最長、造成經濟損失最大的一類急性傳染病 （Fernandez-Bravo 和Figueras，2020）。 由帶有大量毒力因子的維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）引起的細菌性疾病， 在水生生物個體免疫力低下或體表有創傷的情況下更容易被感染， 暴發時可造成較高的死亡率（ Li 等，2020）。 雖然抗生素的使用最快捷有效， 但隨之產生的抗藥性會影響水產養殖品種本身細菌感染的治療， 并通過人畜共患病或將耐藥性基因轉移到人類， 增加人類抗生素耐藥性的風險（Henriksson 等，2018）。 嗜水氣單胞菌對四環素、卡那霉素、氨芐西林、呋喃妥因、喹諾酮類等多種抗生素耐藥 （Preena 等，2020； 任亞林等，2019），維氏氣單胞菌耐受氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、 青霉素G、 萬古霉素、 克林霉素等藥物（Prediger 等，2020；Tekedar 等，2020）。 為此，各種抗生素類藥物替代品的研究如乳酸菌因可應用于水產動物體內和體外環境， 達到防治疾病和提高水產品質量的目的，具有替代抗生素的潛力（張靜等，2020；Ringo 等，2018）。

大多數乳酸菌都能產生抗多種病原微生物的抗菌分子。 乳酸菌產生的主要抑菌物質包括有機酸、抗菌肽、過氧化氫等（Mbawala 等，2013）。 乳酸菌對于多種病菌均有抑菌作用， 孫夢桐等（2020）在鯉魚腸道中篩選到的乳酸乳球菌LY3-1， 對哈維氏弧菌群體感應及生物膜的形成具有抑制作用。Kong 等（2020）在烏鱧的腸道分離到的糞腸球菌和乳酸乳桿菌對于維羅氏菌JL-8155、 嗜水氣單胞菌ATCC 7966、 沙門氏菌ATCC 27013 有拮抗活性。Alonso 等（2019）在13 種海洋魚類腸道中分離獲得乳酸乳球菌乳酸亞種、腸球菌屬、植物乳桿菌、 腸膜明串珠菌腸膜亞種， 其對于哈維氏弧菌、美人魚發光桿菌、燦爛弧菌具有廣譜抑菌性。

基于乳酸菌的廣譜抑菌性， 本研究擬在魚類腸道和南太湖水體中分離篩選乳酸菌菌株， 并以其對維氏氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的拮抗作用進行相關研究， 旨在以乳酸菌微生態制劑添加到水產養殖飼料中提升魚類抗病力和免疫力。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 乳酸桿菌肉湯培養基（LBM）、MRS 肉湯培養基、革蘭氏染色試劑盒、MR-VP 生化管、甲基紅試劑盒、硫化氫生化管、明膠生化管、V-P 試劑盒： 青島高科技園海博生物技術有限公司；瓊脂：國藥集團化學試劑有限公司；輕質碳酸鈣（1250 目）：山東優索化工科技有限公司；胰蛋白胨、氯化鈉、酵母浸提物、過氧化氫試劑、細菌基因組DNA 抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備 疊加式恒溫振蕩箱（搖床）：蘇州捷美電子有限公司；兩槽式培養箱：重慶雅馬拓科技有限公司；生物安全柜、PCR 擴增儀：力康生物醫療科技控股有限公司力新儀器（上海）有限公司； 立式滅菌器： 山東新華醫療器械股份有限公司；凝膠成像儀、電泳儀：美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 魚： 在湖州市中心農貿市場隨機購買鮮活的鯉魚、鯽魚、黃顙魚、鳊魚、太湖白魚。 水樣：在南太湖北緯30°57'、東經120°7'附近水域采集水樣（表1）；在湖師院德清湖湖邊采集水樣，編號為DC。

表1 水樣采集信息

1.3.2 菌液富集與篩選 在生物安全柜內無菌解剖魚， 獲取腸道稱重后加入5 倍的生理鹽水充分研磨制備菌懸液。 將魚腸道菌懸液和10 mL 水樣加入到乳酸桿菌肉湯培養基中，37 ℃、160 r/min培養24 h 至菌液完全渾濁， 使用0.9%生理鹽水將菌液進行梯度稀釋至10-5， 涂布在1%碳酸鈣MRS 瓊脂培養上，置于37 ℃培養箱倒置培養24 h，挑取有明顯透明溶鈣圈的菌落進行反復劃線傳代，直至鏡檢確認純培養物。

1.3.3 形態學鑒定 提取上述純菌落四區劃線在MRS 瓊脂培養基上，37 ℃培養24 h， 觀察菌落形態。并進行革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性菌進行下一步試驗。

1.3.4 生理生化鑒定 參照凌代文的《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行生理生化鑒定。

1.3.4.1 過氧化氫酶試驗 在載玻片上滴加新鮮配制的3% H2O2， 挑取菌落置于H2O2液滴中，觀察30 s 內有無氣泡產生，發生氣泡為陽性，不發生氣泡者為陰性。

1.3.4.2 明膠液化試驗 取菌落穿刺接種在明膠培養基內，37 ℃培養48 h， 取出后放4 ℃冰箱30 min，如果內容物不凝固呈液態狀，則為陽性，如內容物凝固不流動，則為陰性。

1.3.4.3 硫化氫試驗 有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物， 而產生硫化氫氣體，H2S 會使培養基中的醋酸鉛形成黑色的硫化鉛。

1.3.4.4 甲基紅MR 試驗 取適量瓊脂培養物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR-VP）中，37 ℃培養24 h。 滴加甲基紅試劑5 滴，立即觀察結果。 鮮紅色為陽性，黃色為陰性。

1.3.4.5 V-P 試驗 提取3 ～5 個單菌落接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水（MR-VP）中，37 ℃培養24 h，滴加V-P 試劑盒A 液0.6 mL（6 滴）與培養物充分混勻后，再添加B 液0.2 mL（2 滴）混勻即可。振搖試管后靜置0.5 ～2 h。 觀察結果陽性反應：伊紅色；陰性反應：不變色或棕黃色。

1.3.5 16S rDNA 鑒定 使用細菌基因組DNA 抽提試劑盒提取細菌基因組DNA， 正向引物為27f（5'-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3'）， 反向引物 為 1492r （5' -TACGGY -TACCTTTGTTAC GACTT-3'）， 引物由上海生工生物技術公司合成。PCR 擴增反應體系為DNA 模板1.0 μL、Taq PCR Master mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、 上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR 擴增反應程序為，95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，循環35 次，4 ℃保溫。

PCR 產物檢測：預先制備1%的瓊脂糖凝膠，擴增反應完畢后， 取2 μL 的PCR 產物與2 μL 6×Loading buffer 混合，加樣于瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳， 電壓5 V/cm， 電泳液為1×TAE，25 min 后取出。 將擴增成功的PCR 產物送至擎科生物技術有限公司測序。 測序結果經校對后將分離得到的乳酸菌的16S rRNA 序列結果在NCBI 上進行Blast 相似性分析，選擇同源性較高的菌株的16S rRNA 序列，以鄰接法運用MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。

1.3.6 抑菌試驗 維氏氣單胞菌（GDMCC 1.893）和嗜水氣單胞菌（ATCC 35654）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

菌液的制備：維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌挑取單菌落接入LB 肉湯，28 ℃培養OD600至2.0；挑取乳酸菌單菌落接種于MRS 肉湯培養基，37 ℃培養OD600至2.0。

制作雙層瓊脂培養基：以8 mL 的MRS 瓊脂為底，放置3 個牛津杯，待LB 瓊脂培養基溫度降至40 ～43 ℃時， 加入1%濃度的病原菌充分混勻，倒入MRS 瓊脂上，待其凝固緩慢取出牛津杯。在牛津杯A 孔中加入100 μL 的無菌水作為陰性對照，B 孔中加入100 μL 的500 μL/mL 硫酸慶大霉素溶液作為陽性對照，C 孔中加入100 μL 的乳酸菌菌液，室溫靜置3 h 后將培養基正置于28 ℃培養箱，24 h 后觀測抑菌圈大小， 并用游標卡尺測量。

2 結果與分析

2.1 分離篩選結果 經過富集培養和篩選，共篩選到5 株疑似乳酸菌菌株。 在鯉魚腸道內分離到一株疑似乳酸菌，命名為L；在鯽魚腸道內分離到一株疑似乳酸菌，命名為J；在太湖白魚腸道內分離到一株疑似乳酸菌，命名為T；在太湖水樣5-1中分離到一株疑似乳酸菌，命名為T5-1；在德清湖水樣中分離到一株疑似乳酸菌，命名為DC2。

2.2 形態學鑒定結果 經過MRS 碳酸鈣平板劃線分離和革蘭氏染色， 共得到5 株疑似乳酸菌菌株。 各菌株在MRS 碳酸鈣平板上可形成3 ～5 mm 的透明溶鈣圈，菌落呈乳白色或類白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊。各菌株經革蘭氏染色在顯微鏡油鏡下均為G+：L 株呈短桿形， 菌株細胞單個排列，J 株呈圓球形，菌株細胞成對排列，T 株呈扁圓球形， 菌株細胞單個或成對排列，T5-1 株呈扁圓球形， 菌株細胞單個或成對排列，DC2 株呈不規則短棒狀，菌株細胞成對排列。

圖1 菌株L、J、T、T5-1、DC2 在MRS碳酸鈣平板上形態及革蘭氏染色結果

2.3 乳酸菌生化鑒定結果 對5 株乳酸菌進行過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、甲基紅試驗、明膠液化試驗、V-P 試驗五項生化鑒定， 結果見表2。由表2 可知， 菌株L、J、T、T5-1、DC2 的過氧化氫酶試驗，硫化氫試驗，V-P 試驗為陰性；甲基紅試驗為陽性。 菌株L、J、T5-1、DC2 明膠液化試驗為陰性，菌株T 明膠液化試驗為陽性。

表2 各菌株的生理生化鑒定結果

2.4 16S rDNA 鑒定結果 以提取的純化菌株基因組DNA 為模板， 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2 所示。16S rDNA 擴增產物在1000 ～2000 bp ，產物的電泳條帶單一且清晰，滿足測序要求。將5 株菌株的測序結果與GenBank 中已知序列進行同源性比對，確定測序菌株的種屬信息，結果見表3。

圖2 乳酸菌PCR 產物電泳

表3 乳酸菌純化菌株16S rDNA 鑒定結果

經MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹如圖3，菌株L 與Lactobacillus plantarum在同一分支，同源性達到100%，相似性為100%，可確定L 株為植物乳桿菌。 菌株DC2 與Weissella paramesenteroides在同一分支，同源性達到100%，相似性為100%，可確定DC2 株為類腸膜魏斯氏菌。 菌株T與Enterococcus faecalis在同一分支，同源性達到100%，相似性為100%，可確定T 株為糞腸球菌。菌株J 和T5-1 兩者與Lactococcus lactis在同一分支，同源性達到100%，可確定J 和T5-1 株為乳酸乳球菌。

2.5 乳酸菌的抑菌能力 所分離到的乳酸菌對于兩種病原菌均有一定的抑制效果， 在嗜水氣單胞菌的平板上，100 μL 的500 μL/mL 硫酸慶大霉素溶液產生的抑菌圈大小平均為22.8 mm， 菌株J、T5-1、DC2、T、L 的 抑 菌 圈 大 小 分 別 為26、22、21、19、18 mm。在維氏氣單胞菌的平板上，100 μL的500 μL/mL 硫酸慶大霉素溶液產生的抑菌圈大小平均為15 mm， 菌株L、DC2、J、T、T5-1 的抑菌圈大小分別為24、21、17、16、14 mm。

圖4 乳酸菌發酵液對指示菌的抑制作用

3 討論與小結

本次分離鑒定得到的菌種在水產養殖中大多有過相關報道：植物乳桿菌對鮰魚愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和魯氏耶爾森氏菌三種斑點叉尾鮰潛在致病菌具有較好拮抗作用， 具有較好的耐受膽鹽能力， 對Caco-2 細胞具有一定的黏附作用（Mbawala 等，2013）。 在鯽魚腸道內分離到的屎腸球菌對于維氏氣單胞菌具有一定的抑制作用（Kong 等，2020）。 在斜帶石斑魚腸道分離到的乳酸乳球菌和糞腸球菌， 對嗜水氣單胞菌、 溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌以及大腸桿菌5 種致病菌有抑制作用，抑菌直徑為9.5 ～22.5 mm（Alonso等，2019）。在飼料中添加乳酸乳球菌JCM5805，可促進尼羅羅非魚的生長， 提高飼料利用率和成活率，并能提高尼羅羅非魚對于無乳鏈球菌的抗性；同時JCM5805 改善了尼羅羅非魚腸道微生物群落構成，增加了腸道有益菌的存在，降低了潛在致病菌的分布并且能夠在尼羅羅非魚的腸道內增殖（Mao 等，2020）。在烏鱧腸道分離到的乳酸乳球菌和糞腸球菌，烏鱧經維氏氣單胞菌攻擊后，基礎日糧中添加乳酸菌飼喂的烏鱧存活率顯著增加（Kong 等，2020）。 類腸膜魏斯氏菌可發酵葡萄糖產生乳酸，常用于發酵泡菜醬油，在水產養殖中的應用較少。 本試驗結果與以上研究中的植物乳桿菌、 糞腸球菌和乳酸乳球菌的抑菌拮抗效果基本一致。

乳酸菌除了具有抑菌活性， 還可作為疫苗的抗原載體，使用共表達SVCV 糖蛋白（G）和KHV ORF81 蛋白的基因工程植物乳桿菌作為口服疫苗，通過口服疫苗誘導鯉魚的保護性免疫，可控制鯉魚春季病毒血癥和錦鯉皰疹病毒病 （Yao 等，2020）。在養殖對蝦中添加乳酸桿菌可以改善養殖水質，提升對蝦對白斑綜合征病毒（WSSV）的抗病毒能力，增強對蝦的免疫應答（Naiel 等，2021）。乳酸菌作為魚類腸道中的益生菌， 對于魚類生長發育、免疫抗病、維持腸道系統功能發揮著至關重要的作用。 本研究由動物腸道和南太湖水體中分離到的土著乳酸菌，添加至養殖飼料中，更具有同源性，更易于在魚類腸道中定植和發揮益生作用。濃度為500 μL/mL 的慶大霉素對嗜水氣單胞菌的抑菌直徑為22.8 mm， 所分離到的兩株乳酸乳球菌、類腸膜魏斯氏菌抑菌直徑達26、22、21 mm，與抗生素效果基本一致，糞腸球菌、植物乳桿菌的抑菌直徑為19、18 mm。 濃度為500 μL/mL 的慶大霉素對維氏氣單胞菌的抑菌直徑為15 mm，植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌的抑菌直徑為24、21 mm，抑菌效果顯著高于抗生素；乳酸乳球菌（J）、乳酸乳球菌（T5-1）、糞腸球菌的抑菌直徑為17、14、16 mm，抑菌效果和抗生素基本一致。 抑菌圈雖然隨著時間推移而變小， 但是到48 h 后仍有（10±2）mm 的抑菌圈， 表明乳酸菌菌液的抑菌時效性較長， 可為后續開發功能性水產養殖微生態飼料提供資源和參考。