益生菌固態發酵紅薯渣條件的研究

王 微， 梅世慧， 陳江鳳， 陳 超， 周碧君，2，3， 文 明，2，3

（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點試驗室；貴州貴陽 550025；3.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴州貴陽 550025）

1 材料與方法

1.1 主要材料 產朊假絲酵母（Candida utilis，C.u）與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，L.p），購自上海保藏生物科技有限公司； 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S.c）、 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，B.l）、 枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilis，B.s）、短 小 芽 孢 桿 菌（Bacillus pumilus，B.p）與糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.f），由貴州省動物疫病與獸醫公共衛生重點實驗室提供。 紅薯，購自貴州惠民生鮮超市。 YPD 培養基，購自北京百奧萊博科技有限公司；普通營養培養基，購自杭州微生物試劑有限公司；MRS 培養基， 購自索萊寶生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 BD53 恒溫培養箱 （德國賓得公司），QYC-2102C 恒溫搖床（上海新苗醫療器械制造公司），K9860 全自動凱氏定氮儀 （海能未來技術集團股份有限公司），WA-003 破壁榨汁機 （潁上力程儀器設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵底物制備 紅薯洗凈切塊， 放入榨汁機打碎，三層紗布過濾，放入白瓷盤，置于60 ℃烘箱，20 min 攪拌一次，2 h 取出， 置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 益生菌復蘇及種子液制備 無菌環挑取菌種接種相應培養基（酵母菌接種YPD 培養基、乳酸菌接種MRS 培養基、 芽孢桿菌接種普通營養培養基），酵母菌30 ℃、乳酸菌和芽孢桿菌37℃恒溫培養24 h；挑取單個菌落接種相應液體培養基，恒溫搖床（180 r/min）培養12 h，取3 mL菌液接種相應100 mL 液體培養基中， 恒溫搖床（180 r/min）培養24 h 取出種子液；采用平板稀釋涂布法測定種子液菌液濃度，用滅菌水稀釋至1×109cfu/mL，放入4 ℃冰箱備用。

1.3.3 益生菌拮抗試驗 取益生菌種子液， 分別劃線于YPD 培養基、MRS 培養基與普通營養培養基，37 ℃恒溫培養24 h，觀察生長情況，篩選均適宜7 株益生菌生長的培養基； 再取7 種益生菌劃線，觀察拮抗性。

1.3.4 基于粗蛋白質產物菌株篩選 參考歐榮娣等（2015）方法，按3%（V/m）接種量，將產朊假絲酵母、植物乳桿菌、釀酒酵母、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌與糞腸球菌菌液接種于100 g 紅薯渣中，30 ℃恒溫發酵3 d 取出，60 ℃烘干恒重，通過國標GB/T 6432-2018 測定粗蛋白質含量，以粗蛋白質含量為指標進行益生菌菌株篩選。

1.3.5 復合益生菌固態發酵條件優化

第五孔窯洞開間3.28m，進深7m，室內空間狹長，此處是裝載糧食的空間，南側設窗但不設門，進入此處只能通過第四孔窯洞，這樣既保證了室內的通風采光，使糧食的存放時間更長，也保證了糧食的存放安全，避免了外來人直接進入糧食裝載區。

1.3.5.1 單因素試驗 以粗蛋白質含量高的4 種益生菌以1：1：1：1 混合， 于0%、1%、3%、5%、7%和9%（V/m）接種量接種100 g 紅薯渣，30 ℃恒溫發酵3 d 取出，測定粗蛋白質含量，篩選出最佳菌液接種量。 以最佳接種量接種8 袋紅薯渣，30 ℃恒溫發酵，于0、1、2、3、4、5、6 d 和7 d 取出，測定粗蛋白質含量。

1.3.5.2 正交試驗 采用L9（34）正交試驗設計，以粗蛋白質含量為指標，根據單因素試驗結果以最佳接種量和最佳發酵時間前后兩個值， 與發酵溫度（28、30、32 ℃）進行正交試驗。

1.3.6 紅薯渣最佳發酵條件驗證 根據上述篩選得到的最佳條件（益生菌菌種、接菌量、發酵時間和發酵溫度）進行發酵，以粗蛋白質含量為指標驗證。

1.4 數據統計與分析 上述試驗均設三個重復，檢測結果數據用SPSS 軟件進行分析， 以 “平均值±標準差” 表示， 其中P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 益生菌拮抗試驗結果 酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌在YPD 培養基生長：7 種益生菌拮抗試驗結果如圖1， 其中產朊假絲酵母與枯草芽孢桿菌拮抗， 植物乳桿菌與短小芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌、 枯草芽孢桿菌拮抗， 糞腸球菌與短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌拮抗。

圖1 益生菌拮抗性試驗結果

2.2 基于粗蛋白質含量菌種篩選結果 7 種益生菌發酵紅薯渣中粗蛋白質含量變化結果見表1；由高至低順序分別為： 產朊假絲酵母＞地衣芽孢桿菌＞植物乳桿菌＞釀酒酵母＞糞腸球菌＞枯草芽孢桿菌＞短小芽孢桿菌， 較未發酵紅薯渣顯著提高29.92% 、25.76% 、15.51% 、14.40% 、11.63% 、5.54%、1.11%（P＜0.05）。 根據拮抗試驗植物乳桿菌與地衣芽孢桿菌拮抗，因此添加產朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌（1：1：1：1）復合發酵。

表1 7 種益生菌發酵紅薯渣中粗蛋白質含量%

2.3 復合益生菌固態發酵條件優化

2.3.1 單因素試驗 添加產朊假絲酵母、 釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌（1：1：1：1）混合菌液，于不同接種量發酵， 紅薯渣中粗蛋白質含量變化結果見圖2； 粗蛋白質含量隨菌液接種量的增加先升高后下降。 以最佳接種量5%進行不同時間發酵，結果見圖3；粗蛋白質含量隨時間延長先上升后下降，最佳發酵時間為4 d。

圖2 不同接種量粗蛋白質含量

圖3 不同發酵時間粗蛋白質含量

2.3.2 正交試驗結果分析 以粗蛋白質含量為指標， 根據單因素試驗結果最佳接種量和最佳發酵時間前后兩個值 （3、4、5 d） 和 （3%、5%、7%），與發酵溫度（28、30、32 ℃）進行正交試驗，因素水平組合見表2。正交試驗結果見表3，3 個因素主次順序為C＞B＞A；最佳發酵條件為A1B3C3， 即發酵時間3 d， 菌液接種量7%， 溫度32℃。 正交試驗方差分析結果見表4，表明A、B、C 3 個因素對提高發酵紅薯渣中粗蛋白質影響差異均不顯著。

表2 紅薯渣發酵條件優化正交試驗因素與水平

表3 紅薯渣固態發酵工藝條件L9（34）正交試驗結果與分析

2.4 紅薯渣最優發酵條件驗證 于最佳發酵條件添加產朊假絲酵母+釀酒酵母+植物乳桿菌+糞腸球菌（1：1：1：1）混合菌液，接種量7%、32 ℃發酵3 d，測定粗蛋白質含量進行驗證，結果見圖4；較未發酵紅薯渣中粗蛋白質顯著提高39.27%（P＜0.05），與正交試驗No.2 條件發酵紅薯渣中粗蛋白質含量（4.47±0.056）（P＞0.05）差異不顯著，表明紅薯渣最優發酵條件可行。

圖4 最優發酵條件粗蛋白質含量變化

3 討論

紅薯渣由于水分過多難以保存與利用， 烘干成本高且破壞紅薯渣中酚類化合物與胡蘿卜素等成分。 Shen 等（2018）研究發現，利用益生菌發酵紅薯渣可延長保存時間、改善風味、保留胡蘿卜素以及酚類物質。Shivashankara 等（2004）研究表明，益生菌發酵紅薯渣能夠有效提高抗氧化酚、 脂肪酸和植物固醇含量， 其中抗氧化酚可抑制癌細胞增殖。益生菌生長繁殖過程中會產生有機酸，包括乳酸、乙酸和丁酸等，可降低腸道pH，抑制病原菌生長（袁明貴，2021；Mu，2020；翟羽佳，2018）。 綜上所述益生菌發酵紅薯渣可產生營養物質、 抗氧化物質、益生物質并延長保存時間，因此研究發酵紅薯渣作為動物飼料具有重要意義（Klempová，2020；王明瑞，2020；Shi，2017）。

本研究以粗蛋白質為指標， 添加篩選得到的4 種益生菌復合發酵， 于不同接種量和不同發酵時間進行單因素試驗。不同接種量發酵，紅薯渣中粗蛋白質含量先上升后下降； 由于添加菌液量過大，使微生物生長速率加快，營養消耗釋放能量，發酵溫度提高，導致酵母菌失活；與宋平等（2018）和陳洪偉等（2011）研究發酵糟渣中，接種量增大粗蛋白質含量先上升后下降結果相一致。 不同時間發酵，紅薯渣中粗蛋白質含量先升高后下降；因為益生菌生長繁殖分遲緩期、對數期、穩定期與衰亡期，進入衰亡期發酵能力逐漸降低，所以導致粗蛋白質含量下降；與蘇玲（2021）研究油茶籽濕渣發酵隨發酵時間延長粗蛋白質含量先上升后下降結果一致。

不同發酵條件可直接影響紅薯渣中粗蛋白質含量，本研究通過正交試驗對3 種發酵條件（菌液接種量、發酵時間和發酵溫度）進行優化。 添加2種酵母菌（產朊假絲酵母和釀酒酵母）與2 種細菌（植物乳桿菌和糞腸球菌）復合發酵，酵母菌與細菌適宜生長溫度不同， 兩種益生菌生長溫度相差7 ℃， 篩選適宜復合菌種生長繁殖溫度至關重要（陳明，2021；林森，2008）；通過正交試驗確定最佳發酵溫度為32 ℃，可使產朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌4 種益生菌生長繁殖達到最適溫度。 發酵時間會直接影響紅薯渣中粗蛋白質含量， 發酵時間過短紅薯渣中成分未完全利用，發酵時間過長生產成本高；本研究最佳發酵時間為3 d， 該發酵時間能高效利用紅薯渣中殘留的營養成分，與陳炳鈿等（2020）研究最優發酵工藝中最佳發酵時間3 d 相一致。 相較單因素試驗最優發酵條件5%接種量于30 ℃發酵4 d， 正交試驗中最佳條件7%接種量32 ℃恒溫發酵3 d，增加2%接種量提高2 ℃發酵溫度可縮短1 d 發酵時間，可有效降低工業生產成本。

歐榮娣等（2015）研究的紅薯渣固態發酵條件優化，將紅薯渣高壓滅菌后發酵，滅菌紅薯渣發酵費時費力；本研究采用未高壓的紅薯渣發酵，不僅降低工作量，還防止高壓使紅薯渣蛋白產生變性，更符合生產實際。 綜上所述添加益生菌發酵紅薯渣可有效提高紅薯渣中粗蛋白質含量， 為發酵紅薯渣工藝奠定理論基礎。

4 結論

本研究篩選出產朊假絲酵母、釀酒酵母、植物乳桿菌和糞腸球菌4 種益生菌，以1：1：1：1 復合發酵，確定最佳發酵條件為菌液接種量7%（V/m）、溫度32 ℃和時間3 d，表明益生菌發酵紅薯渣可提高粗蛋白質含量。