柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆與表達分析

鄒曉燕， 王林杰， 黃 杰， 羅麗娟， 劉國道， 陳志堅,*

(1. 海南大學熱帶作物學院， 海南 海口 570228； 2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業農村部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室， 海南 海口 571101)

金屬元素鐵、錳、銅和鋅等，是植物生長所必需的微量營養元素，它們在植物生長發育過程中起重要作用。微量元素缺乏會影響植物代謝酶活性，導致葉片失綠和植株矮小等現象[1]。然而，金屬元素的過量積累也會破壞細胞結構，造成代謝紊亂[2]。另外，過量的金屬元素可能會通過食物鏈進入人體，影響人類健康。因此，微量營養元素的過量與缺失均會降低作物的產量和品質，是農業生產中亟待解決的問題。

植物可以通過多種金屬轉運蛋白來調節養分的吸收、轉運和分配，從而維持細胞礦質營養平衡[3]。其中，植物天然抗性相關巨噬蛋白(Nramp)是一類具有保守結構和功能的大家族蛋白，參與了多種金屬離子的吸收和轉運，如錳、鐵、鎘和鋁等金屬離子[4]。研究人員首次在小鼠中克隆了Nramp蛋白[5]，隨后在細菌、動物和植物中也相繼報道了Nramp同源蛋白的生物學功能。據報道，擬南芥(Arabidopsisthaliana)包含有6個Nramp蛋白成員，其中，AtNramp1定位于質膜和胞內囊泡，參與了細胞錳離子的轉運及維持鐵離子的穩態[6]。AtNramp2定位于高爾基體，具有調控錳離子再分配的功能[7]。AtNramp3和AtNramp4定位于液泡膜，分別參與了錳和鐵離子的轉運[8]，而AtNramp6定位在囊泡，具有轉運鎘的功能[9]。在水稻(Oryzasativa)中，7個Nramp蛋白均定位于細胞質膜上[10-11]。OsNramp1主要在根中表達，參與水稻鐵、鎘和砷的轉運[12-13]。OsNramp3主要在莖節維管束中表達，是地上部錳分配的重要調節因子[11,14]。OsNramp4是水稻根系吸收鋁離子的轉運蛋白[15]。OsNramp5主要在根中表達，主要參與了水稻對錳和鎘的吸收[10,16]，而OsNramp6主要在幼葉中表達，參與了鐵、錳和鎘的轉運[17]。因此，Nramp蛋白成員具有運輸金屬離子的保守功能。

柱花草(Stylosanthesguianensis)是豆科蝶形花亞科的一個屬，大多數種起源于巴西和哥倫比亞等熱帶國家和地區。柱花草因其適應性強，產量高，在世界熱帶地區被廣泛用作牧草飼料喂養牲畜，并用于豆科綠肥和林果草生態工程建設等[18]。柱花草對土壤缺磷脅迫、鋁和錳金屬元素毒害表現出良好的耐受性，已成為熱帶牧草生理生態研究的重要植物之一。以往研究主要從生理和代謝途徑等方面探索了柱花草適應元素脅迫的機理[19-21]，對柱花草金屬轉運蛋白的克隆及表達分析的研究未見報道。因此，本研究克隆了柱花草Nramp家族成員SgNramp1和SgNramp2基因，并對其進行了生物信息學和基因表達分析，旨在為后續深入分析柱花草SgNramp家族基因的生物學功能提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用試驗材料為‘熱研5號’圭亞那柱花草(Stylosanthesguianensis)，種子保存于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室。

1.2 試驗方法

1.2.1柱花草培養及處理 參考賈怡丹等(2020)方法[22]，將萌發3 d后的柱花草幼苗轉移至Hoagland營養液(pH5.8)中進行培養，營養液包含1 500 μmol·L-1KNO3，400 μmol·L-1NH4NO3，300 μmol·L-1(NH4)2SO4，0.16 μmol·L-1(NH4)5MoO24·4H2O，1 200 μmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，250 μmol·L-1KH2PO4，25 μmol·L-1MgCl2·6H2O，500 μmol·L-1MgSO4·7H2O，300 μmol·L-1K2SO4，1.5 μmol·L-1MnSO4·H2O，1.5 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.5 μmol·L-1CuSO4·5H20，40 μmol·L-1Fe-EDTA(Na)和2.5 μmol·L-1NaB4O7·10H2O。柱花草正常培養14 d后，分別進行以下處理：缺錳(-Mn)，缺鐵(-Fe)，缺銅(-Cu)和缺鋅(-Zn)處理，以全營養液為對照處理，處理液pH為5.8；過量錳(400 μmol·L-1Mn)，鐵(800 μmol·L-1Fe)，銅(10 μmol·L-1Cu)和鋅(20 μmol·L-1Zn)處理，以全營養液為對照處理，處理液pH為5.0。每個處理設置三個生物學重復，處理期間每隔7 d更換一次營養液。處理14 d后，收獲植株樣品，用于RNA提取及基因表達分析。另外，柱花草在含有0(CK)，100 μmol·L-1AlCl3，40 μmol·L-1CdCl2和20 μmol·L-1LaCl2的500 μmol·L-1CaCl2溶液(pH4.5)中處理24 h后，收獲根系樣品，用于RNA提取及基因表達分析。

1.2.2RNA提取和cDNA合成 參照黃杰等[23]方法提取柱花草RNA。稱取0.1 g樣品，加入1 mL TRIzol提取液，充分研磨，4℃下12 000 rpm離心3 min，吸上清至新離心管中。加入氯化鈉(5 mol·L-1)和2/3體積氯仿，充分混勻。4℃下12 000 rpm離心10 min，取上清至新離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min。4℃下12 000 rpm離心10 min，棄上清液，加入1 mL 75%乙醇。4℃下7 500 rpm離心2 min，棄上清，加入1 mL無水乙醇。4℃下7 500 rpm離心2 min，棄上清，風干沉淀，加入無RNase ddH2O溶解RNA。cDNA合成參考HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesie Kit試劑盒(Vazyme，中國)方法。反應體系及程序為：加入5 μL RNase ddH2O，3 μL Total RNA，65℃反應5 min，迅速置于冰上；加入2 μL 5×gDNA wiper Mix，充分混勻，42℃反應2 min；加入2 μL 10×RT Mix，2 μL HiScript III Enzyme Mix，1 μL Oligo(dT)20，5 μL RNase ddH2O，充分混勻后，25℃反應5 min，37℃反應45 min，85℃反應5 sec。cDNA于-80℃保存備用。

1.2.3柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆 根據本實驗室前期柱花草全長轉錄組結果，篩選得到SgNramp1和SgNramp2基因全長cDNA序列。根據序列信息，設計基因特異引物SgNramp1-ORF-F/R和SgNramp2-ORF-F/R(表1)。以根系cDNA為模板，進行PCR擴增得到SgNramp1和SgNramp2基因。將PCR產物克隆到pMD18-T載體(Takara，中國)上，并進行測序分析。

表1 SgNramp1和SgNramp2基因全長克隆和定量PCR引物Table 1 Primers for SgNramp1 and SgNramp2 full-length cloning and qRT-PCR analysis

1.2.4SgNramp1和SgNramp2基因生物信息學分析 利用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析基因的氨基酸數、分子量和等電點；通過HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)進行亞細胞定位預測分析；通過HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)進行蛋白保守結構域預測和跨膜結構域分析；使用MAGA-X并結合EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)構建系統進化樹。

1.2.5SgNramp1和SgNramp2基因表達分析 使用QuantStudioTMReal-Time PCR(Thermo Fisher，美國)系統和SYBR Green(Vazyme，中國)定量試劑盒進行實時定量PCR(qRT-PCR)分析。定量PCR反應體系包括10 μL 2×SYBR Green PCR master mix，2 μL cDNA模板(稀釋倍數50)、1 μL引物(10 μmol·L-1)，并補足ddH2O至20 μL；反應程序為：95℃ 1 min，95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環。基因相對表達量為目的基因表達量除以內參基因(SgEF1a)表達量。

1.2.6數據統計分析 數據采用Microsoft Excel 2010進行分析和作圖，并用軟件SPSS v23.0(SPSS Institute，美國)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆

本研究根據柱花草全長轉錄組測序結果獲得的SgNramp1和SgNramp2基因全長序列，設計基因全長克隆引物，以柱花草根系cDNA為模板，擴增出SgNramp1和SgNramp2基因cDNA全長序列。SgNramp1基因全長為1 654 bp，而SgNramp2基因全長為1 716 bp(圖1)。

圖1 SgNramp1和SgNramp2全長cDNA的克隆Fig.1 Full lengths cloning of SgNramp1 and SgNramp2 注：Marker，DL2000 DNA Marker；1，柱花草SgNramp1基因擴增產物；2，柱花草SgNramp2基因擴增產物Note:Maker,DL2000 DNA maker;1,PCR product of SgNramp1;2,PCR product of SgNramp2

2.2 SgNramp1和SgNramp2蛋白特性分析

利用Expasy在線工具分析表明SgNramp1和SgNramp2蛋白分別包含有544和557個氨基酸，分子量分別為59.5 kDa和61.0 kDa，等電點分別為8.2和5.2。亞細胞定位預測分析發現兩個蛋白都定位在細胞質膜上，可能為膜蛋白。

2.3 SgNramp1和SgNramp2蛋白保守結構域分析

利用HMMER對SgNramp1和SgNramp2蛋白進行保守結構域分析，結果表明SgNramp1和SgNramp2均屬于Nramp蛋白家族成員，均包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且包含有12個跨膜結構域(圖2)。

圖2 SgNramp1 (A) 和SgNramp2 (B) 蛋白保守結構域分析Fig.2 Analysis of conserved domains of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)

2.4 系統進化樹分析

系統進化樹分析表明，擬南芥、水稻、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)和苜蓿(Medicagotruncatula)等不同植物的Nramp蛋白可以被分為3大組，并進一步被分為6個亞組(圖3)。柱花草SgNramp1被分在第I組中，與擬南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3，大豆GmNramp5a/5b/6a/6b和苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白同屬一個亞組，且SgNramp1與大豆GmNramp5a/5b具有較高的同源性。SgNramp2被分在第II組，與擬南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp4a/4b和苜蓿MtNramp3等Nramp蛋白同屬一個亞組，且SgNramp2與MtNramp3同源性最高(圖3)。

圖3 SgNramp1和SgNramp2與其他植物Nramps蛋白系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of SgNramp1 and SgNramp2 with other Nramp proteins注：At,擬南芥；Os,水稻；Hv,大麥；Cs,黃瓜；Mt,苜蓿；Zm,玉米；Gm,大豆；Pt,毛果楊；Sg,柱花草Nramps蛋白Note:At,Arabidopsis thaliana;Os,Oryza sativa;Hv,Hordeum vulgare;Cs,Cucumis sativus;Mt,Medicago truncatula;Zm,Zea mays;Gm,Glycine max;Pt,Populus trichocarpa;Sg,Stylosanthes guianensis

2.5 柱花草SgNramp1/2基因組織表達分析

本研究通過RT-PCR方法，分析了SgNramp1和SgNramp2基因在柱花草不同組織中的表達模式。由圖4A和4B所示，SgNramp1基因在柱花草根中的表達量顯著高于葉中的表達量(P<0.05)，而SgNramp2基因則在葉中特異性表達。另外，本研究也分析了SgNramp1/2在柱花草新葉(NL)、成熟葉(ML)和老葉(OL)中的表達。結果發現，SgNramp1基因在新葉中的表達量最高，成熟葉和老葉次之；然而，SgNramp2基因在老葉中的表達量顯著高于新葉的表達量(P<0.05)(圖4C和4D)。

圖4 柱花草SgNramp1和SgNramp2基因組織表達分析Fig.4 Expressions of SgNramp1 and SgNramp2 in different tissues注：圖中不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05)Note: Different letters indicate significant differences among different tissues at the 0.05 level

2.6 不同元素脅迫處理對SgNramp1/2基因的表達的影響

本研究分析了錳、鐵、鋅和銅等元素缺乏和過量脅迫處理對SgNramp1/2基因在柱花草葉和根中表達的影響。由圖5可知，和CK相比，雖然SgNramp1/2基因對元素缺乏的響應不一樣，但缺錳(-Mn)處理均顯著抑制了SgNramp1/2基因在葉和根中的表達(P<0.001)。缺鋅(-Zn)和銅(-Cu)處理增強了SgNramp1基因在根中的表達，但對SgNramp1基因在葉中的表達影響不顯著(圖5A,5B)。缺鐵(-Fe)和-Cu處理增強了SgNramp2基因在葉中的表達，但-Mn，-Fe，-Zn和-Cu處理均抑制了SgNramp2基因在根中的表達(圖5C,5D)。

圖5 不同元素缺乏處理對SgNramp1和SgNramp2基因表達的影響Fig.5 Effects of element deficiency on SgNramp1 and SgNramp2 expressions 注：*表示不同處理與對照(CK)間差異顯著(*, 0.01

由圖6可知，元素過量脅迫對SgNramp1/2基因表達的調控有所差異。過量錳(+Mn)和鋅(+Zn)處理顯著增強了SgNramp1在葉中的表達(P<0.05)，而過量鐵(+Fe)和+Zn處理則增強了SgNramp1在根中的表達(圖6A,6B)。+Mn處理抑制了SgNramp2在葉中的表達，但卻增強了SgNramp2在根中的表達；+Fe處理增強了SgNramp2在葉中的表達，而+Zn處理則增強了SgNramp2在根中的表達(圖6C,D)。另外，過量銅(+Cu)處理均顯著抑制了SgNramp1在葉和根中的表達(P<0.05)，但卻增強了SgNramp2基因在葉和根中的表達(圖6)。

圖6 不同元素過量處理對SgNramp1和SgNramp2基因表達的影響Fig.6 Effects of excess elements on SgNramp1 and SgNramp2 expressions注：A和B，SgNramp1在葉(A)和根(B)中的表達量；C和D，SgNramp2在葉(C)和根(D)中的表達量。星號表示不同處理與對照(CK)間差異顯著(*, 0.01

2.7 不同金屬處理對SgNramp1/2基因表達的影響

本研究進一步分析了金屬鋁(100 μmol·L-1Al)、鎘(40 μmol·L-1Cd)和鑭(20 μmol·L-1La)處理對SgNramp1/2基因在柱花草根中表達的影響。由圖7可知，SgNramp1/2基因對不同金屬處理響應不一樣。與對照CK相比，鎘(Cd)處理顯著增強了SgNramp1基因在根中的表達(P<0.001)，而鋁(Al)和鑭(La)處理則抑制了SgNramp1基因的表達(圖7A)。然而，與對照CK相比，鋁、鎘和鑭處理均增強了SgNramp2基因的表達，且SgNramp2基因在鎘處理下表達量最高，鋁和鑭處理下次之(圖7B)。

圖7 不同重金屬處理對SgNramp1(A)和SgNramp2(B)基因表達的影響Fig.7 Effects of heavy metal treatments on the expressions of SgNramp1 (A) and SgNramp2 (B)注：星號表示不同處理間差異顯著(*, 0.01

3 討論

細胞礦質營養平衡對維持植物生長和發育具有重要的影響，植物Nramp蛋白被報道在金屬離子吸收、轉運和分配過程中起重要作用[24]。研究表明，在擬南芥中，包括6個AtNramps蛋白[25]，在水稻中，包含7個OsNramps蛋白[10]，而在大豆中則包含13個GmNramps蛋白[24]。不同植物的Nramp蛋白家族成員具有高度保守的SLC5-6-like-sbd結構域，且一般具有10～12個跨膜結構域[24,26]。本研究發現，柱花草SgNramp1和SgNramp2也包含有Nramp蛋白SLC5-6-like_sbd superfamily保守序列，且均包含有12個跨膜結構域(圖2)，表明SgNramp1和SgNramp2屬于Nramp蛋白家族成員。并且，亞細胞定位預測表明SgNramp1和SgNramp2均定位在細胞質膜上，暗示其可能具有轉運金屬離子的功能。

不同植物的Nramp蛋白被報道參與了轉運錳和鐵等金屬離子[4,24]。在系統進化樹中，柱花草SgNramp1與擬南芥AtNramp1/6，水稻OsNramp3以及苜蓿MtNramp1/6等Nramp蛋白被分在第I大組中(圖3)。研究發現，擬南芥AtNramp1蛋白定位在質膜中，nramp1突變體在缺錳條件下不能正常生長，且組織錳濃度低于野生型植株，進一步分析發現AtNramp1是負責擬南芥根系錳吸收的高親和錳轉運蛋白，并具有轉運鐵的能力[25]。另外，擬南芥AtNramp6被報道定位在囊泡內膜上，可能參與了鎘的運輸[9]。因此，柱花草SgNramp1可能具有與擬南芥AtNramp1/6類似的生物學功能，參與細胞錳和鎘的轉運。柱花草SgNramp2與擬南芥AtNramp2/5、大豆GmNramp3a/3b和苜蓿MtNramp3等同第II組。研究表明，擬南芥AtNramp2定位在高爾基體中，主要負責錳在高爾基體中的再分配，突變AtNramp2基因顯著抑制了缺錳條件下擬南芥根系的生長[7]，這暗示了SgNramp2參與錳離子轉運。

在本研究中，SgNramp1基因主要在柱花草根中表達，而SgNramp2基因則在葉中特異性表達，并且，SgNramp1基因在新葉中的表達量最高，而SgNramp2基因則在老葉中的表達量最高(圖4)。AtNramp1在根部中的表達量高于地上部，且缺錳和缺鐵脅迫均增強了擬南芥AtNramp1在根中表達，進一步分析發現AtNramp1主要負責根系對錳元素的吸收[25,27]，而AtNramp6則主要在葉中表達，參與了擬南芥對鎘轉運和積累[9]。在水稻中，OsNramp3主要在莖節中表達，是調節水稻地上部錳分配的重要基因[11]。在本研究中，缺錳處理抑制了SgNramp1基因在根和葉中的表達，而金屬鎘處理則增強了SgNramp1基因在根中的表達(圖5和圖7)，這些結果暗示了柱花草SgNramp1參與細胞錳和鎘的轉運。另外，本研究發現，缺鐵處理增強了SgNramp2基因在葉中的表達，而鋁和鎘處理也增強了SgNramp2在根中的表達(圖5和圖7)。然而，與SgNramp2較同源的擬南芥AtNramp2主要在根部中表達，雖然AtNramp2表達量不受缺錳、缺鐵和缺鋅等脅迫的影響，但其具有調控錳離子再分配的生物學功能[7]。因此，SgNramp2可能具有與擬南芥AtNramp2不同的離子轉運機制，其潛在的生物學功能仍需要進一步挖掘。

4 結論

綜上所述，本研究克隆了柱花草SgNramp1和SgNramp2基因。結果發現柱花草SgNramp1和SgNramp2基因表達具有組織特異性，并且，SgNramp1和SgNramp2基因表達受到不同金屬元素脅迫處理的調控，暗示其可能具有調節金屬離子轉運的功能。本研究為進一步挖掘SgNramp1和SgNramp2基因的生物學功能提供了研究方向及參考。