結縷草ZjSGR基因在離體模擬逆境脅迫環境下的功能

茅遠煜， 李麗菁， 李進超， 張嘉航， 段夢琪， 許立新*

(1.北京林業大學草業與草原學院, 北京 100084； 2.浙江大學農業與生物技術學院, 浙江 杭州 310058)

葉綠素(Chlorophyl)在綠色植物光合作用進程中發揮著重要作用，它具有捕獲光能并驅動電子轉移到反應中心的功能[1]。在衰老和脅迫作用下，葉綠素均會發生降解[2]。大部分學者認為PAO途徑是葉綠素代謝的主要途徑[3-5]，葉綠素的降解由葉綠素酶(Chlorophyllase，CHLase)、脫鎂螯合酶(Mg-dechelatase，MDCase)、脫鎂葉綠素酶(Pheophytin pheophorbide hydrolase，PPH)、脫鎂葉綠酸a加氧酶(Pheophorbide a oxygenase，PAO)、紅色葉綠素代謝產物還原酶(Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR)等酶進行催化。但有些植株在葉片衰老過程中葉綠素不降解或降解不明顯，在生長末期葉片仍保持綠色或是部分黃化,這種在植株衰老時葉片保持綠色的現象稱為“滯綠”[6]。大量研究表明滯綠基因SGR的功能與葉綠素降解調控有關[7]。滯綠基因SGR的功能和調控機理在擬南芥(ArabidopsisthalianaL. Heynh.)、多年生黑麥草(LoliumperenneL.)、番茄(LycopersiconesculentumMiller)和水稻(OryzasativaL.)等植物和作物中進行了相關研究。研究顯示SGR蛋白可以催化葉綠素a的脫鎂反應，又可以與光捕捉系統Ⅱ蛋白與其他降解酶形成蛋白酶復合體調控葉綠素的降解[8]。結縷草與其他草坪草相比，抗逆性相對較強，是一種優秀的草坪草和牧草。北京林業大學草坪研究所前期開展了關于結縷草ZjSGR基因的研究。滕珂在結縷草中克隆了調控葉綠素降解的重要基因ZjSGR，并發現ZjSGR影響植物的衰老進程和生長發育[9]。檀鵬輝等人通過農桿菌介導法將ZjSGR基因轉入煙草(NicotianatabacumL.)中發現過表達ZjSGR基因加速煙草葉綠素的降解[10]。李麗菁等人通過基因編輯獲得Zjsgr突變株系，同時，發現突變植株與對照相比葉綠素含量更高[11]。

目前研究多集中在ZjSGR基因在葉綠素降解過程中的調控作用，ZjSGR基因在逆境脅迫中的作用和功能研究很少。本研究對項目組前期獲得Zjsgr突變株系和野生對照株系進行葉片離體處理及離體低溫處理，以模擬不同的逆境脅迫環境，檢測葉綠素含量、MDA含量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性，對ZjSGR基因“滯綠”功能進行驗證，并初步分析逆境下ZjSGR“滯綠”功能喪失對其他生理指標的影響，探究ZjSGR基因在逆境脅迫中的可能作用，為后續研究提供參考，并為結縷草“滯綠”品種的選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗所用植物材料來自日本結縷草‘Chinese Common’一個株系的組織培養材料(CC1)獲得的野生對照植株(WT)與突變體植株(sgr)。試驗設置3個處理，分別是對照，離體處理和低溫離體處理，每個處理3次重復。對照處理標記為S-WT,Sr-sgr；離體處理葉片在0.3 mmol MES緩沖液中進行常溫離體培養9 d[12]，標記為E-WT,E-sgr；低溫離體處理葉片在0.3 mmol MES緩沖液以及低溫(3±1)℃培養箱中離體培養47 d，標記為CE-WT,CE-sgr。

1.2 生理指標測定方法

葉綠素含量采用分光光度法[12]，取長勢良好的結縷草葉片(0.05 g)分別添加到含有8 mL 95%乙醇的10 mL離心管中，用錫紙避光靜置24 h，最后用紫外分光光度計依次測665 nm，649 nm下的吸光度值；按照公式計算葉綠素含量。

C葉綠素=6.63A665+18.08A645

A665,A645分別為665 nm，649 nm下的吸光度值采用氮藍四唑光還原法[13]測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，活性以抑制氯化硝基四氮唑藍(Nitrotetrazolium blue chloride，NBT)還原反應50%所需酶量為一個酶活單位(U)。采用愈創木酚法[13]測定過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，以每分鐘內A470處OD值變化0.01為一個酶活單位(U)。采用紫外吸收法[13]測定過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性，以每分鐘內A240減少0.1的酶量定義為一個酶活單位(U)。采用硫代巴比妥酸法[14]測定丙二醛含量。以牛血清蛋白為標樣，用考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度[15]，按照標準曲線計算蛋白質濃度。

y=0.001 51x+0.451 75，

相關系數r2=0.992 01

1.3 熒光定量PCR

日本結縷草Total RNA提取使用Takara MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (Takara,Japan-b),參照試劑盒說明書進行操作。cDNA的合成并去除基因組DNA使用PrimeScriotTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara,Japan-a)，參照試劑盒說明書進行操作。引物由北京睿博興科生物技術有限公司設計合成，基因及引物序列見表1：

表1 目的基因和引物序列Table 1 Target gene and primer sequence

熒光定量PCR使用Takara公司TB Green TM Premix Ex TaqTM (TliRNaseH Plus)試劑盒，反應程序以及反應液配制參照試劑盒說明書。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016進行數據整理，采用IBM SPSS Statistics 23開展方差分析和T檢驗。

2 結果與分析

2.1 脅迫處理對野生植株及突變植株葉綠素含量和可溶性蛋白的影響

由圖1a可知，處理前，S-sgr突變植株較S-WT葉綠素含量的均值略高，分別為1.88 mg·g-1與1.81 mg·g-1，但統計學差異不顯著。離體處理條件下，E-WT葉綠素含量與S-WT相比下降至0.88 mg·g-1，較處理前下降51.48%(P<0.05)；E-sgr突變植株葉綠素含量下降至1.17 mg·g-1，較處理前下降37.93%(P<0.05)。離體低溫處理條件下，CE-WT葉綠素含量下降至1.16 mg·g-1，較處理前下降35.96%(P<0.05)；CE-sgr突變植株葉綠素含量為1.35 mg·g-1，較處理前下降28.32%(P<0.05)。因此，離體和離體低溫兩種處理都使野生植株和突變植株的葉綠素含量降低，但離體處理促使野生對照植株葉片葉綠素濃度下降的幅度更大，突變植株葉綠素濃度下降的幅度較小。

由圖1b可知，在處理前和離體處理條件下，sgr突變植株和WT可溶性蛋白含量均保持一致。離體低溫處理47 d時CE-sgr突變植株可溶性蛋白含量為下降至63.7 mg·g-1，較處理前減少44.2 mg·g-1(P<0.05)，CE-WT的可溶性蛋白含量與處理前相比，無顯著變化，可能突變植株在離體低溫條件下保持相對高的葉綠素含量是以較低的可溶性蛋白含量為代償，消耗了葉片的含氮物質(包括可溶性蛋白)。

圖1 不同處理對WT和sgr突變植株葉片葉綠素含量以及可溶性蛋白含量影響的比較Fig.1 Comparison of the effects of different treatments on chlorophyll content and soluble protein content in leaves of WT and sgr mutant plants注：不同小寫字母表示不同處理之間存在顯著差異(P<0.05),下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference in the different treatment at the 0.05 level, the same as below

2.2 脅迫處理對野生植株及突變植株抗氧化酶活性的影響

2.2.1SOD酶活性影響 由圖2a可知，在離體處理前、離體處理以及低溫離體處理條件下，sgr突變植株和WT野生植株葉片SOD酶活性均差異不顯著。離體處理使sgr和WT的SOD活性上升，且sgr的SOD酶活性上升幅度更大，具體來看，E-WT的SOD活性上升至7.6×10-3U·g-1FW，為處理前6.9倍(P<0.05)；E-sgr突變植株SOD活性上升至8.7×10-3U·g-1FW，為處理前7.25倍(P<0.05)。離體低溫條件下，CE-WT的SOD活上升至3.7×10-3U·g-1FW，為處理前3.4倍(P<0.05)；CE-sgr突變植株SOD活性上升至2.4×10-3U·g-1FW，為處理前2.0倍(P<0.05)。

2.2.2POD酶活性影響 由圖2b可知，對照條件下，S-sgr突變植株較S-WT野生植株的POD活性較高，分別為9 720 U·g-1·min-1和5 120 U·g-1·min-1，說明處理前，突變植株氧化活性物質較高，誘導了較高的POD酶活性，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產生和積累可能是由于相對高的葉綠素和葉綠素代謝中間產物使植物細胞受到更多的光氧化毒性作用。離體處理條件下E-WT的POD活性上升，而E-sgr突變植株POD活性下降；離體低溫處理條件下，CE-WT的POD活性與處理前比無顯著差異，CE-sgr突變植株POD活性下降至5280 U·g-1·min-1(P<0.05)。

2.2.3CAT酶活性影響 由圖2c可知，在離體處理前S-sgr突變植株和S-WT的CAT活性差距不顯著。離體處理對兩組植株的CAT活性影響均不顯著；離體低溫處理下，CE-sgr突變植株的CAT活性顯著高于CE-WT(P<0.05)，分別為15.37 U·g-1·min-1和5.60 U·g-1·min-1，說明突變植株清除過氧化氫的能力更高。

2.2.4APX酶活性影響 由圖2 d可知，在對照條件下，S-sgr突變植株顯著高于S-WT的APX活性，分別為1.346 U·mg-1和0.725 U·mg-1，變化模式和POD相似。離體處理使E-WT的APX活性上升至1.171 U·mg-1，E-sgr突變植株APX活性下降至0.921 U·mg-1(P<0.05)；離體低溫處理條件下，CE-WT的APX活性為0.479 U·mg-1，較處理前差異不大，CE-sgr突變植株APX活性下降至0.764 U·mg-1，較處理前下降43.24%(P<0.05)。

圖2 不同處理對WT和sgr突變植株葉片抗氧化酶活性影響的比較Fig.2 Comparison of the effects of different treatments on antioxidant enzyme activities in leaves of WT and sgr mutant plants

2.3 脅迫處理對野生植株及突變植株MDA含量的影響

由圖3可知，在對照條件下，S-sgr突變植株較S-WT的MDA含量略高，分別為0.125 nmol·g-1FW和0.099 nmol·g-1FW(統計學分析差異不顯著)。離體處理條件下，E-WT的MDA含量為0.099 nmol·g-1FW，較處理前并未發生顯著變化，E-sgr突變植株MDA含量下降至0.096 nmol·g-1FW，較處理前下降22.61%(P<0.05)；在離體低溫處理條件下，CE-sgr突變植株的MDA含量顯著低于CE-WT的MDA(P<0.05)。離體處理和低溫離體處理都使sgr突變植株的MDA含量減少。

圖3 不同處理對WT和sgr突變植株葉片MDA活性影響的比較Fig.3 Comparison of effects of different treatments on MDA activity in leaves of WT and sgr mutant plants

2.4 突變植株及野生植株葉綠素降解相關基因差異

離體處理誘導WT植株的葉綠素降解基因ZjPAO，ZjRCCR，參與葉綠素循環的基因ZjOSCAO，ZjNYC1不同程度上調表達(圖4)，ZjRCCR基因相對表達量達到7.5214，ZjCHLase，ZjMDCase，ZjHCAR下調表達，相對表達量分別為0.196 6，0.440 2，0.503 9。突變植株葉片在離體條件下，葉綠素降解途徑相關基因也上調表達，如ZjMDCase，ZjPAO，ZjRCCR都上調表達，相對表達量分別為3.234 4，17.545 6，3.928 7，參與葉綠素循環的相關酶編碼基因ZjOSCAO，ZjHCAR上調表達，相對表達量分別為5.268 3，12.742。本結果說明離體處理均不同程度誘導兩組葉片材料的葉綠素降解過程，但影響具體基因表達情況不同。

圖4 突變植株及野生植株葉綠素降解相關基因表達量的比較Fig.4 Comparison of expression of chlorophyll degradation-related genes of WT and sgr mutant plants in plants

與野生植株相比，突變植株中，ZjPAO，ZjMDcase，ZjOsCAO受到離體處理誘導基因上調表達幅度更高，此外參與葉綠素循環途徑的ZjHCAR也上調表達。PAO酶催化有光化學毒性的pheophorbide a進一步氧化降解為紅色葉綠素代謝物(RCC)，ZjRCCR是RCC還原酶基因，催化RCC向初始熒光葉綠素代謝物質轉化(pFCC)的關鍵一步，是葉綠素降解代謝物由綠色到黃色、紅色以及無色過程中變化節點的關鍵酶之一[16]。突變植株與野生植株相比，ZjHCAR和ZjPAO表達量的大幅提升說明植株的光毒性葉綠素代謝物質升高，受到了更高程度的光氧化脅迫。ZjOSCAO相對表達量為5.268 3，催化葉綠素b的形成，ZjHCAR相對表達量達12.742，ZjHCAR酶催化有光化學毒性的7-hydroxymethylChla轉化為葉綠素a[17]。因此，總體來看，突變植株ZjMDcase，ZjPAO，ZjOSCAO，ZjHCAR等基因上調表達有助于清除有光化學毒性的葉綠素代謝物，促進葉綠素a和b的轉化，減弱細胞受到的光氧化傷害。

突變植株葉片在離體條件下ZjNYC，ZjPPH和ZjRCCR與對照植株相比相對表達量下降，對照植株的相對表達量分別為1.805 3，0.808 4，7.521 4，而突變植株的相對表達量分別為0.152 0，0.175 1，3.928 7。ZjNYC的下調表達意味著葉綠素b的進一步降解可能被抑制；ZjPPH催化脫鎂葉綠素pheaophytin脫植基轉化為脫鎂葉綠酸phaeophorbide，進一步被PAO催化降解，ZjPPH表達量下降可能一定程度抑制此通路葉綠素降解過程。

3 討論

葉綠素以及部分葉綠素代謝產物都是植物葉色呈現綠色的主要色素。在衰老或脅迫響應的進程中，植物的綠色葉片會褪綠，隨脅迫程度和時間的持續葉綠素含量不斷減少[18]。本研究結果顯示，在未處理的對照條件下，sgr突變植株的葉綠素含量均值略高于對照植株葉片，但統計學分析差異不顯著。李麗菁[11]研究顯示，突變植株從草坪表觀質量和葉綠素含量方面均高于對照。可能由于兩次研究采樣來自不同植株生長發育階段，可測到的葉綠素含量在不同生長發育階段會有不同結果。離體條件下，sgr突變植株葉綠素含量降幅較野生型高，說明結縷草ZjSGR基因突變能夠一定程度上抑制葉綠素的降解，進一步驗證了ZjSGR基因的功能是促進葉綠素降解。周志湘等人[19]的研究結果也表明，在匍匐剪股穎(Agrostisstolonifera)中ZjSGR基因過表達導致了葉綠素降解加快，且ZjSGR表達水平越高，葉綠素含量越低。

從葉綠素降解途徑相關基因表達來看，sgr突變植株相較于野生植株ZjPPH，ZjRCCR以及ZjNYC1表達量較低，其他基因均明顯高表達。ZjNYC1基因低表達與ZjOsCAO基因高表達可能控制了葉綠素的分解，使其停留在葉綠素循環階段；突變sgr基因的植株降低了ZjPPH，ZjRCCR基因表達量，ZjPPH，ZjRCCR基因的低表達可能在減緩葉綠素降解進程中發揮關鍵作用；相較于野生植株，突變植株ZjMDCase，ZjPAO，ZjHCAR表達量上升有助于加快清除光毒性葉綠素代謝產物，減少光氧化對膜系統的傷害，但其具體作用機理還需進一步研究確定。

MDA是膜脂過氧化的產物。植物葉片中MDA的含量常作為判斷植物受到脅迫程度的重要生理指標，一般植物受脅迫程度越大MDA含量越高[20]。離體條件下，sgr突變植株的MDA含量下降而野生型含量上升，結合突變植株中部分抗氧化酶活性較高的情況，以及前期研究結果，說明逆境條件下，ZjSGR基因的喪失能夠降低細胞膜脂的過氧化損傷，減少MDA的積累?；钚匝跏瞧茐闹参锛毎は到y的重要物質[21]。活性氧的產生是有氧代謝的必然結果，當植物受到逆境脅迫時，植物體內會產生過量的活性氧，形成氧化脅迫，對植物造成氧化損傷[21]。2012 年，Sakuraba等提出了SGR-CCEs-LHCⅡ的葉綠素降解模型，捕光色素蛋白復合體(light-harvesting complex，LHC)是一類能夠捕獲光能，并將能量迅速傳遞至反應中心，引起光化學反應的色素蛋白復合體[22]。SGR-CCEs-LHCⅡ模型認為在植物葉綠體中，葉綠素以色素蛋白復合體的形式存在于LHCⅠ/LHCⅡ中，當葉綠素發生降解時SGR蛋白與LHCⅡ中色素蛋白的輔基蛋白相結合形成SGR-LHCⅡ復合體，這種結合會導致LHCⅡ的結構不穩定，同時SGR蛋白募集CCEs使之與葉綠素更容易結合進行降解反應，從而促進葉綠素的降解[8]。根據此模型，我們推測本試驗的逆境條件下ZjSGR基因突變使得捕光色素復合體(LHC)的穩定性未受到影響，葉綠素不易降解，且ZjSGR功能的喪失可能減少了潛在的過剩光能捕獲，使得光捕獲系統協調能力更加高效，減少ROS產生，降低MDA的積累。鄧永勝在研究中也發現LeLhcb2基因過表達，降低了轉基因煙草ROS的積累，并認為在逆境條件下轉基因煙草對兩個光系統中的光能分配具有更高效的協調能力，從而減少了過剩的光能，降低ROS的積累[23]。

在脅迫下抗氧化酶活性在一定程度上反映了植物應對脅迫的能力[24]。sgr突變植株在離體處理下， SOD活性上升較高，在離體低溫處理下SOD活性上升較少。SOD酶活性上升較高，一方面說明突變植株葉片受到的氧化脅迫可能較高，另一方面也說明植株清除過氧化物的能力也同時提升。突變植株在脅迫中受到更多的氧化脅迫可能與相對較高的葉綠素含量有關。在離體逆境處理下，sgr突變植株的SOD活性上升幅度較野生型大；而低溫離體處理下，SOD活性上升幅度小，說明離體低溫處理下，突變植株受到更低程度的氧化脅迫。過氧化氫酶(CAT)與抗壞血酸過氧化物酶(APX)能有效地清除H2O2等活性氧基團，防止細胞膜氧化損傷[25]。ROS清除酶活性存在補償機制，例如，植物中CAT酶活性下降后，其他酶活會發生上調，當植物同時缺失APX和CAT時，植物反而應對脅迫有更好的表現。這可能是由于光合作用下降，抑制ROS在葉綠體的產生，APX和CAT活性下降[26]。在本試驗中相較于野生植株，sgr突變植株CAT和APX活性均下降，可能是由于sgr突變植株葉綠體中的ROS含量較少，這一點和MDA含量的結果一致。因此，我們推測ZjSGR基因缺失導致植物更能適應光氧化脅迫，因此能夠抑制逆境下結縷草葉綠體中ROS的含量，但其作用機理還有待下一步的深入研究。

可溶性蛋白是植物重要的滲透調節物質[27]。在脅迫條件下植物葉片可以通過可溶性蛋白含量的上升維持細胞的滲透勢和保水能力，從而保證細胞膜的穩定性[28]。離體條件下sgr突變植株葉片可溶性蛋白含量上升幅度較野生型植株更大，而低溫離體處理sgr突變植株可溶性蛋白含量下降。這可能是因為sgr突變植株在短時間的離體處理條件下，迅速利用滲透調節機制抵抗脅迫；而在長時間的低溫離體處理下，維持高含量的葉綠素含量最終使sgr突變植株可溶性蛋白含量下降。

4 結論

本研究以日本結縷草ZjSGR基因突變植株為試驗材料，通過離體和離體低溫處理，模擬逆境條件進行了ZjSGR基因的功能分析。研究結果發現突變ZjSGR基因能夠影響葉綠素降解相關基因表達量，進一步證明了sgr突變植株在逆境條件下具有較好的持綠性和較強的抗衰老能力。推測ZjSGR基因可能使植物更好的應對氧化脅迫，在逆境下可能與植物捕光蛋白復合體和葉綠素降解酶互作且能夠影響活性氧的積累，但其作用機制有待進一步探討。本論文研究結果說明ZjSGR基因參與葉綠素降解的同時可能會影響植物抗逆性，為進一步全面研究和了解ZjSGR基因功能奠定了基礎。