紫花苜蓿atpA基因的克隆及表達模式分析

李莉萍， 李旭漉， 張曉捷， 谷麗麗， 張 博

(西部干旱荒漠區草地資源與生態教育部重點實驗室， 新疆草地資源與生態重點實驗室， 新疆農業大學草業學院，新疆 烏魯木齊 830052)

ATP合酶a亞基是由atpA基因編碼的葉綠體蛋白，α亞基構象的變化會導致ATP的合成/水解[1]，因此atpA是光合作用不可缺少的基因[2]。目前，葉綠體atpA基因已經從一些植物[包括藻類，裸子植物和高等植物，如衣藻(Chlamydomonas)[3]，煙草(Nicotianatabacum)[4]，玉米(Zeamays)[5]，擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]，水稻(Oryzasativa)[7]和黑松(Pinusthunbergii)[8]]中分離出來。由于α亞基在ATP合酶的催化過程中發揮關鍵作用，因此研究編碼α亞基的atpA基因在化學、遺傳學和酶學水平下的表達與調控具有重要意義。

已有研究顯示，atpA基因參與植物的非生物脅迫響應。巨芒(Miscanthusgiganteus)在低溫脅迫后，其atpA基因的表達上調[9]。Asrar等[10]研究表明，積累更多的atpA可能會促進ATP的合成，以滿足植物對持續耐鹽性的更大能量需求。Suda等人研究發現ATP合酶基因與植物耐鹽性和植物防御有關[11-12]。灰霉病處理番茄(LycopersiconesculentumMill.)96 h后，顯著誘導了atpA基因表達，表明atpA過量表達可以抵御病害的傷害[13]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)以“牧草之王”著稱，由于其蛋白含量高，被作為家畜飼養的重要原料之一。然而，在苜蓿種植過程中，由于受到土壤、環境(鹽、堿、干旱和光照)等因素影響，苜蓿產量受限。植物光合作用對于植物的生長至關重要，是植物生長的基礎和生產力構成的主要因素[14]。研究紫花苜蓿葉綠體基因的相關功能，對紫花苜蓿抗逆性研究和遺傳育種尤為重要。

本研究從‘新疆大葉’苜蓿中克隆獲得了atpA的cDNA序列，預測分析了其理化性質、親疏水性、磷酸化位點、跨膜結構、信號肽、亞細胞定位、蛋白結構以及序列一致性，并對atpA基因在新疆‘大葉’苜蓿的不同組織、不同生育期及不同非生物脅迫下的表達進行了檢測，為進一步明晰atpA基因在植物抗逆響應中的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘新疆大葉’苜蓿種子由新疆農業大學新疆草地資源與生態重點實驗室提供。選飽滿種子種植在混合花土中(蛭石∶花土=3∶1)，于人工氣候室25℃恒溫培養，16 h光照，8 h黑暗。

1.2 MsatpA基因克隆

根據NCBI中已注冊的‘新疆大葉’苜蓿基因組序列(登錄號：SRR9026569)信息，采用GeneRunner軟件設計基因克隆引物，上游引物MsatpA-F：ATGGTAACCATTCGTGCAGATG，下游引物MsatpA-R：TCAATTTTTTTCTACTTGTTCC。利用RNAiso Plus(Code No.9108，Takara)提取‘新疆大葉’苜蓿總RNA，使用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1621，Thermo)將RNA反轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，擴增體系參照說明書。PCR反應程序為：94℃預變性2 min，94℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸1 min 40 s，25個循環，72℃延伸5 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過膠回收產物連接到克隆載體pMDTM18-T Vector Cloning(Code No. 6011，Takara)，菌液PCR檢測后送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.3 生物信息學分析

對MsatpA基因進行生物信息學分析所用軟件名稱及網址如表1所示。

表1 生物信息學分析所用軟件的信息Table 1 Information of software used for bioinformatics analysis

1.4 MsatpA基因表達模式分析

分別以‘新疆大葉’苜蓿不同組織、不同生育期和不同非生物脅迫后的幼苗為材料，進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測。不同組織選取苜蓿的根、莖、葉、花、莢果、種子，不同生育期選取苜蓿的苗期、分枝期、開花期和結莢期。非生物脅迫處理方法是選取生長至4周齡的幼苗分別進行低溫(4℃)、高溫(40℃)、鹽脅迫(NaCl 250 mM)和滲透脅迫(15% PEG6000)，分別在處理0 h，3 h，6 h，12 h，24 h，48 h時采樣，每個處理設置3個重復。根據MsatpA基因序列，利用NCBI blast primer設計特異性定量PCR引物(表2)，以紫花苜蓿Actin[15]作為實時熒光定量PCR的內參基因，使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit(code No.208052 QIAGEN)說明書配置熒光定量PCR體系，反應程序為：95℃預變性2 min，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環，利用Microsoft Excel 2016和Origin 2018軟件處理數據和制作圖表，以2-ΔΔCt法計算MsatpA基因的相對表達量，通過SPSS Statistics 23對數據進行顯著性分析。

表2 MsatpA基因熒光定量PCR引物序列Table 2 The primer sequence of MsatpA gene qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 MsatpA基因的克隆與序列分析

通過PCR對MsatpA基因進行擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物檢測，結果顯示片段大小約為1 500 bp(圖1A)，與預期試驗結果相符。測序結果表明，克隆得到的MsatpA基因編碼區包含1 533 bp，編碼510個氨基酸(圖1B)。由Conserved Domains-NCBI對蛋白結構域預測分析：MsAtpA在第23～507氨基酸之間含有ATP合酶CF1α亞基結合位點，屬于atpA superfamily家族(圖1C)。

圖1 ‘新疆大葉’苜蓿MsatpA基因PCR擴增產物(A)，氨基酸序列(B)，保守結構域(C)Fig.1 PCR amplification product of MsatpA (A) of Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’,amino acid sequence (B),and the conserved domains (C)注：圖A中M為DL2000；1為MsatpA PCR擴增片段Note:M in panel A,DL2000;1 in panel A PCR product of MsatpA

2.2 MsatpA基因編碼蛋白質一級結構分析

通過Protparam分析其理化性質，推測MsAtpA蛋白的分子式為C2465H4020N674O765S11氨基酸數量為510，其相對分子質量為55.71 KD，等電點(Isoelectric point，pI)為5.22，不穩定系數為32.33，平均疏水性為-0.047，表明MsAtpA蛋白為穩定性親水蛋白質。編碼蛋白質一級結構預測各種氨基酸占比分析結果見表3。結果顯示，MsAtpA蛋白中含量較多的氨基酸是亮氨酸(Leu)，占10%。

表3 MsAtpA氨基酸組成分析Table 3 Amino acid composition analysis of MsAtpA

2.3 MsatpA基因編碼蛋白質二級結構、三級結構分析

運用SOPMA軟件分析‘新疆大葉’苜蓿MsatpA基因編碼的蛋白產物二級結構，MsAtpA蛋白二級結構包含α-螺旋(43.92%)、無規則卷曲(29.02%)、延伸鏈(18.24%)和β-轉角(8.82%) (圖2A)。MsAtpA蛋白產物三級結構使用Swiss-Model Workspace建模預測(圖2B)，其與真核藻類植物萊茵衣藻的蛋白質三級結構(圖2C)相似。

圖2 MsAtpA二級結構(A)，MsAtpA三級結構(B)，CrAtpA三級結構(C)Fig.2 Secondary structure of MsAtpA (A),Tertiary structure of MsAtpA (B),and Tertiary structure of CrAtpA (C)注：A.‘新疆大葉’苜蓿AtpA二級結構圖；B.新疆大葉苜蓿AtpA(MsAtpA)三級結構圖；C.萊茵衣藻AtpA(CrAtpA)三級結構圖Note:A. Secondary structure diagram of AtpA in Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’;B. Tertiary structure of AtpA in Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’ (MsAtpA);C. Tertiary structure of AtpA in Chlamydomonas reinhardtii (CrAtpA)

2.4 MsatpA基因編碼蛋白質的磷酸化位點、跨膜結構、親/疏水性、信號肽及亞細胞定位預測分析

使用NetPhos預測MsAtpA蛋白的磷酸化位點(圖3A)。分析結果顯示，該蛋白含有絲氨酸(Ser)位點23個、蘇氨酸(Thr)位點13個和酪氨酸(Tyr)位點2個，表明該蛋白發生磷酸化時主要以絲氨酸磷酸化為主。采用TMHMM Server 2.0進行預測分析，結果表明MsAtpA跨膜螺旋線數為0，MsAtpA蛋白的1～510位氨基酸都位于細胞膜表面(圖3B)，因此預測MsAtpA蛋白無跨膜轉運信號，不是膜上受體。利用ProtScale軟件分析MsAtpA蛋白質的親水性和疏水性(圖3C)，結果表明第196位酪氨酸的疏水性最強，預測值為2.689，第470位脯氨酸的親水性最強，預測值為-2.411。因此推測MsAtpA蛋白屬于親水性蛋白。信號肽是用于蛋白質跨膜轉移的短肽鏈。信號肽預測結果顯示，MsatpA基因編碼的蛋白無信號肽(圖3D)，說明MsAtpA蛋白屬于非分泌性蛋白。利用Cell-PLoc對MsAtpA蛋白亞細胞定位預測，結果顯示MsAtpA蛋白定位于葉綠體中。

圖3 新疆大葉苜蓿MsAtpA磷酸化分析(A)，跨膜結構域(B)，親/疏水性(C)及信號肽分析(D)Fig.3 Phosphorylation analysis of Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’ MsAtpA (A),transmembrane structure (B),hydrophilicity analysis (C),and signal peptide analysis (D)

2.5 MsatpA基因編碼氨基酸序列同源性比對分析

在NCBI Blastp中對atpA基因編碼的蛋白序列進行同源性檢索，獲取了多個物種的AtpA蛋白序列，包括黃花苜蓿(YP_009327942.1)、蒺藜苜蓿(YP_001381721.1)、鷹嘴豆(YP_002149740.1)、車軸草(YP_009027189.1)、花生(YP_009472162.1)、大豆(YP_007516887.1)、菜豆(YP_001122813.1)、玉米(NP_043022.1)、水稻(NP_039380.1)、地錢(NP_039282.1)、萊茵衣藻(NP_958406.1)、擬南芥(NP_051044.1)、白菜(ASY93521.1)、甘藍(YP_009564560.1)、陸地棉(YP_538920.1)、可可(YP_004021302.1)、木薯(YP_001718422.1)、蓖麻(YP_005090163.1)、煙草(CAA23471.1)、番茄(YP_008563073.1)、馬鈴薯(YP_009915959.1)。利用MEGA-X構建系統進化樹(圖4)，通過NCBI Batch CDD預測不同物種間基因的保守結構域，結果表明MsAtpA蛋白與同為豆科苜蓿屬的黃花苜蓿(YP_009327942.1)、蒺藜苜蓿(YP_001381721.1)有著較高的同源性，說明‘新疆大葉’苜蓿與它們在進化關系上最為相近。蛋白序列比對結果顯示，‘新疆大葉’苜蓿MsAtpA與黃花苜蓿的一致性高達99.80%，僅在第264位氨基酸存在差異位點，與蒺藜苜蓿的一致性為98.24%，與同科植物鷹嘴豆一致性達到98.43%，與其他豆科植物也有著較高的一致性。不同物種的atpA基因都含有ATP合酶α亞基結合位點(圖4)，表明了atpA基因在不同物種間有著高保守性。

圖4 AtpA蛋白進化樹分析Fig.4 Evolutionary tree analysis of AtpA proteins注：AtpA蛋白在不同物種中的進化關系：黃花苜蓿，‘新疆大葉’苜蓿，蒺藜苜蓿，鷹嘴豆，車軸草，花生，大豆，菜豆，玉米，水稻，地錢，萊茵衣藻，擬南芥，白菜，甘藍，陸地棉，可可，木薯，蓖麻，煙草，番茄，馬鈴薯Note:Evolutionary relationship of AtpA protein in different species:Medicago falcata,Medicago sativa L. ‘Xinjiang Daye’,Medicago truncatula,Cicer arietinum,Trifolium subterraneum,Arachis hypogaea,Glycine max,Phaseolus vulgaris,Zea mays,Oryza sativa,Marchantia paleacea,Chlamydomonas reinhardtii,Arabidopsis thaliana,Brassica pekinensis,Brassica oleracea,Gossypium hirsutum,Theobroma cacao,Manihot esculenta,Ricinus communis,Nicotiana tabacum,Solanum lycopersicum,Solanum tuberosum

2.6 MsatpA基因的表達模式分析

實時熒光定量表達分析結果顯示，MsatpA基因在‘新疆大葉’苜蓿不同組織中的表達量不同(圖5A)，在葉中的相對表達量最高，其次是莖、莢果、種子和花，在根中表達量最少。不同生育期基因的表達模式分析結果顯示(圖5B)，MsatpA基因在開花期的表達量最低，結莢期的表達量顯著增高，是分枝期的22.8倍，是苗期的53.7倍，是開花期的103.7倍。低溫處理MsatpA基因表達量顯著上調，處理24 h時表達量最高(圖6A)，是對照的6.6倍。‘新疆大葉’苜蓿在受到高溫脅迫后MsatpA基因的表達量均低于0 h，在24 h達到最低(圖6B)。在250 mM NaCl處理下MsatpA基因表達量呈現先降低再升高又急劇下降的趨勢(圖6C)。15% PEG6000處理后，MsatpA基因顯著上調，基因表達量在24 h達到最高(圖6D)，是對照的3.4倍。以上試驗結果表明，MsatpA基因的表達受不同逆境脅迫條件的影響呈現出不同的表達特點。

圖5 MsatpA的組織特異性及在不同發育期的表達模式Fig.5 Issue-specific and expression pattern of MsatpA in different fertility stages注：不同小寫字母分別代表在0.05水平差異顯著，下同Note:Different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level,the same as below

圖6 MsatpA在非生物脅迫處理下的表達模式Fig.6 Expression patterns of MsatpA gene under different abiotic stresses注：A.低溫脅迫(4℃)處理MsatpA基因的表達量；B.高溫脅迫(40℃)處理MsatpA基因的表達量；C.鹽脅迫(250 mM NaCl)處理MsatpA基因的表達量；D.滲透脅迫(15% PEG6000)處理MsatpA基因的表達量Note:A. Expression of MsatpA gene under cold stress (4℃);B. Expression of MsatpA gene under hot stress (40℃);C. Expression of MsatpA gene under the salt stress (250 mM NaCl);D. Expression of MsatpA gene under osmotic stress (15% PEG6000)

3 討論

ATP合酶a亞基是由atpA基因編碼的葉綠體蛋白，α亞基位于ATP合酶CF1上與ATP-β亞基構成旋轉馬達的圓柱體，α-β界面是ATP水解或合成的催化中心，α亞基具有調節性[1]。本研究從‘新疆大葉’苜蓿中克隆獲得了1 533 bp核苷酸序列，編碼510個氨基酸，通過蛋白質序列分析發現其是一種穩定的親水蛋白，其中α螺旋占主要部分。沒有發現強信號肽序列，表明AtpA不能從葉綠體轉運到細胞質中，這與Shao等[2]在甘薯中對atpA的研究結果一致。蛋白激酶和蛋白磷酸化位點參與細胞信號轉導，‘川草2號’老芒麥(ElymussibiricusL.)AtpA的序列中存在多處蛋白激酶和酪蛋白激酶磷酸化位點，推測atpA可能在細胞信號轉導過程中起作用[16]。這與本研究結果相似，MsAtpA蛋白也含有多個Ser，Thr和Tyr磷酸化位點。蛋白質的三級結構是蛋白質在其二級結構的基礎上依靠氨基酸側鏈之間的分子作用力進一步盤繞、折疊所形成的天然構象，蛋白質三級結構與其功能密切相關[17]。萊茵衣藻是細胞研究中的模式植物，其作為分子生物學研究工具多用于研究細胞核和葉綠體轉化及光合作用等機制[18]，本研究中MsAtpA的三級結構與萊茵衣藻的三級結構預測模型相似，表明AtpA在這兩種植物中可能具有相似的功能。AtpA蛋白在不同物種間具有較高的保守性，突變率低，同科植物的同源性高。高家翔等[19]對早園竹(PhyllostachyspropinquaMcClure)葉綠體atpA基因序列的研究也表明該基因與同科植物具有較高的保守性，這與本研究結論相似。

許多研究表明atpA基因在植物不同組織中表達量不同。銀杏(GinkgobilobaL.)葉中GbatpA的轉錄物的水平明顯高于莖，在根和果實中未檢測到轉錄物積累[20]。甘薯(IpomoeabatatasL.)中IbatpA基因在幼葉中的相對表達量高于成熟葉、莖和塊根的基因表達量[2]。擬南芥atpA基因在莢果中表達量最高，除根以外的各個組織都有所表達，存在明顯的組織特異性[21]。本研究結果與前人研究結果相似，說明atpA基因的表達在不同植物中有一定的相似性和差異性，MsatpA基因在不同發育時期的表達模式也表明了atpA基因在植物的不同生長發育過程中也可能具有不同的調控功能。

非生物脅迫在不同程度上影響植物的生長發育，導致植物生長遲緩、減產甚至死亡，植物進化出多種調控機制來適應不斷變化的環境[22]。atpA基因在抵御逆境環境脅迫中的應答已有多篇文獻報道，擬南芥atpA基因在受到冷脅迫誘導后相對表達量顯著上調，可能參與擬南芥CBFs冷調控通路，對atpA突變體冷脅迫后清除活性氧相關基因會顯著上調，預測atpA基因可能負調節清除活性氧相關基因[21]。何興文等[16]研究發現在低溫脅迫時‘川草2號’老芒麥atpA基因轉錄受到影響，可能會影響ATP合酶的活性以及細胞信號轉導。對羽穗草(DesmostachyabipinnataL.)進行不同鹽濃度脅迫處理后葉綠體蛋白AtpA的表達在不同鹽濃度處理下發生改變[10]。胡楊(Populuseuphratica)atpA基因在高溫條件下會做出熱激響應[23]。葉綠體是光合作用的場所，也是眾多反應代謝的場所，葉綠體內的代謝平衡較為脆弱，輕微脅迫刺激就會使其做出響應，本研究中MsatpA基因的表達也受不同非生物脅迫誘導，表明該基因在紫花苜蓿中也參與脅迫應激調控。

植物抗逆基因功能的研究有助于了解植物在脅迫條件下的抗逆機制。近年來，越來越多的研究者對苜蓿抗逆相關基因進行了克隆和表達分析研究[24-26]，已有研究報道atpA基因參與抗病[13]、抗鹽[10]及抗冷[22]脅迫響應。此外，atpA基因編碼ATP合酶的α亞基，參與植物的能量代謝過程，影響植物的光合作用，在進化方面相對保守。本研究克隆了紫花苜蓿葉綠體atpA基因，并對基因表達模式進行了初步分析，這為后期atpA基因在能量代謝及抗逆性方面的功能研究奠定了基礎，也為苜蓿遺傳育種提供理論依據。

4 結論

本研究從紫花苜蓿中克隆得到了MsatpA基因序列，對其進行了生物信息學分析和基因表達模式分析，初步確定MsatpA基因在紫花苜蓿中參與不同非生物脅迫應答，為后續深入探究atpA基因在苜蓿中的功能奠定了基礎。