大葉山螞蝗葉片響應缺磷脅迫的脂質代謝組分析

鄭韶爵， 朱厚榮， 羅佳佳， 劉攀道， 羅麗娟， 劉國道*， 董榮書*

(1. 海南大學熱帶作物學院， 海南 海口 570228； 2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所， 海南 海口 571101)

磷(Phosphorus，P)是植物生長發育所必需的大量營養元素之一，參與了生物膜和核酸的合成、新陳代謝、酶的活性調節等重要生物過程[1]。我國南方土壤呈酸性，在酸性土壤中可被植物根系直接吸收的無機可溶磷(Inorganic phosphate，Pi)容易被金屬離子及有機物所固定，形成難溶性無機磷和有機磷，導致磷有效性較低，嚴重限制植物的生長[2]。在農業上，主要通過施用磷肥來緩解土壤缺磷問題，但過量的施用磷肥不僅造成資源浪費，且會導致水體富營養化等環境污染問題[3]。因此，提高作物對土壤磷匱乏的適應能力及磷效率，對發展綠色生態農業具有重要作用。

提高磷效率是植物適應低磷脅迫的重要機制，磷效率主要包括磷吸收效率(P acquisition efficiency，PAE)和磷利用效率(P utilization efficiency，PUE)。在低磷環境下，植物主要通過調整根系形態和構型、分泌磷酸酶和有機酸、增強磷轉運子活性、加強土壤有益微生物互作等，提高根系從土壤中獲取磷素的能力，以提高磷吸收效率[4]。近十年來，大量科研工作者在植物磷吸收效率機理方面取得了諸多成果，其中部分成果已用于育種實踐，指導培育出一批高磷吸收效率作物新品種，包括水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、玉米(Zeamays)等[5-6]。植物提高磷利用效率的機制之一是增加對體內含磷代謝物(磷脂、核酸、磷酸化蛋白等有機磷組分)的磷素循環再利用[7]。植物葉片貯存有大量有機磷，其中磷脂占葉片細胞全磷的15%～20%，是潛在的巨大磷源，故加強磷脂中磷素的循環再利用，能有效緩解低磷脅迫[8]。在缺磷環境中，含磷脂質(磷脂)可被磷脂酶和酸性磷酸酶等水解，產生無機磷酸根(Pi)和二酰甘油(Diacylglycerol，DAG)，其中Pi被分配到生長活躍器官得到再利用，DAG被用于合成半乳糖脂和硫脂等不含磷脂質替代磷脂進行膜脂重塑，維持細胞膜[1]。研究發現，澳大利亞磷貧瘠土壤上的山龍眼科植物新葉磷脂含量較高，而老葉磷脂含量顯著降低，老葉中磷脂被半乳糖脂和硫脂取代，增加了磷利用率，以適應低磷環境[9]。脂質組學作為代謝組學的分支，是研究植物磷脂代謝的有效技術手段[10]。

大葉山螞蝗(Desmodiumgangeticum)是豆科蝶形花亞科山螞蝗屬多年生亞灌木植物，具有根系發達、抗逆性強、生物量大、蛋白質含量高等優點，屬于南方熱帶地區優良牧草和飼料作物之一[11-12]。我國南方土壤普遍面臨低磷脅迫的問題，大葉山螞蝗卻生長良好，而其對低磷脅迫的適應機制仍不清楚。因此，本研究將通過脂質組學，初步分析大葉山螞蝗葉片對缺磷脅迫的響應。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養條件

本研究所用的大葉山螞蝗種子材料是由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究提供。試驗在海南大學熱帶作物學院科研基地大棚中開展，大葉山螞蝗采用Magnavaca營養液(表1)進行水培。試驗流程如下：篩選大小一致、飽滿均一的種子，在80℃水浴鍋中熱激3 min，放于墊有潤濕濾紙的培養皿避光萌發2～3 d，待幼根伸長1～1.5 cm，再轉移至含300 μmol·L-1KH2PO4營養液中預培養10 d。挑選長勢良好、均一的幼苗，分別進行正常供磷(+P，300 μmol·L-1KH2PO4)和缺磷脅迫處理(-P，0 μmol·L-1KH2PO4)。營養液pH為5.8～6.0，每隔3 d換一次每個處理設置3個生物學重復。分別在處理0 d,5 d,10 d,15 d收取地上部和根系樣品，用于生物量和全磷含量的測定。處理15 d時收取所有葉片，用液氮速凍后，于-80℃保存用于脂質代謝組學分析。

表1 改良的Magnavaca營養液配方Table 1 Modified Magnavaca nutrient solution formulation

1.2 試驗方法

1.2.1生物量與全磷含量測定 生物量測定：樣品收獲后放入烘箱中105℃殺青20 min，70℃恒溫烘干至恒重后稱量。

全磷含量測定：將收取的大葉山螞蝗地上部和根系烘干樣品用液氮研磨成粉末，放回烘箱烘至恒重后稱取0.05 g于50 mL消煮管中，加入5 mL濃硫酸，搖勻后放置4 h，使用消煮爐消煮。當溶液冒白煙時逐漸升高溫度，始終保持微沸狀態30 min。當溶液呈棕黑色時加入5～8滴30%過氧化氫，邊滴邊搖晃消煮管至溶液無色，再消煮20 min后冷卻，雙蒸水定容至50 mL，溶液澄清后待測。參照Murphy和Riley[13]鉬銻抗比色法測定OD700吸光度值，計算全磷含量。

1.2.2脂質分子提取 大葉山螞蝗葉片的脂質代謝組學分析在深圳華大基因BGI生物科技有限公司進行。脂質代謝物的提取參考Chauhan等[14]方法進行，略作修改：稱取25 mg樣品放入1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL -20℃預冷的提取液(二氯甲烷∶甲醇=3∶1，V∶V)和10 μL SPLASH內標儲液，管內加入兩顆鋼珠，將混合物放入研磨儀中進行研磨(50 Hz，5 min)，隨后進行水浴超聲(4℃，10 min)，放入-20℃冰箱靜置1 h。樣品離心(4℃，25000 rpm，15 min)。離心后取600 μL上清液進行凍干，加入200 μL重組溶劑(異丙醇∶乙腈∶H2O=2∶1∶1，V∶V∶V)進行復溶，渦旋震蕩1 min，4℃條件下水浴超聲10 min后離心(25 000 rpm，15 min)，取出鋼球，將上清液轉移至1.5 mL上樣瓶中。每個樣本的上清液各取20 μL混合成QC質控樣本，用于評估LC-MS分析過程的重復性和穩定性。

本試驗采用Waters 2D UPLC(Waters，USA)串聯Q Exactive高分辨質譜儀(Thermo Fisher Scientifific，USA)來進行代謝物的分離和檢測。

1.2.3基于高效液相色譜-質譜的代謝組分析 參考McLoughlin等[15]方法進行脂質代謝物的分離、鑒定和定量分析，略作修改。色譜條件：采用CSHC18柱(1.7 μm，2.1×100 mm，Waters，USA)進行UPLC分析。正離子模式的流動相由溶劑A(0.1%甲酸、60%乙腈水溶液、10 mM甲酸銨)和溶劑B(0.1%甲酸、10%乙腈水溶液、90%異丙醇和10 mM甲酸銨)組成。為了進行比較，溶劑A和溶劑B分別為在負離子模式下，不含甲酸(0.1%)。設置梯度洗脫方法如下：40%～43% B(0～2 min)；43%～50% B(2～2.1 min)；50%～54% B(2.1～7 min)；54%～70% B(7～7.1 min)；70%～99% B(7.1～13 min)；99%～40% B(13～13.1 min)；40% B(13.1～15 min)。流量設置為0.35 mL·min-1，柱溫度保持在保持在55℃。注射量設置為5 μL。

質譜條件：利用Q Exactive質譜儀(Thermo Fisher Scientifific，USA)進行一級、二級質譜數據采集。質譜掃描的電荷質量比(m/z)在200～2 000m/z以內。MS1分辨率、自動增益控制(AGC)和最大注入時間(MIT)分別為70 000 ms、3 e6和100 ms。根據前驅體離子強度，選擇前3個離子進行MS2分析，并將MS2分辨率、AGC和MIT的參數分別調整到17，500，1 e5和50 ms。階梯式歸一化碰撞能量(NCE)值分別設置為15，30和45 eV。電噴霧電離(ESI)參數設置為：鞘氣流速40 L·min-1，輔助氣體流速10 L·min-1，正離子模式下3.80(|KV|)噴霧電壓，負離子模式下3.20(|KV|)，離子傳輸管溫度320℃，輔助氣加熱器溫度350℃。為了保證檢測過程中結果的可靠性，對樣品進行了隨機排序，以減少系統誤差。在整個分析分析過程中，每10個樣品注入一次QC樣品。

差異脂質代謝物的鑒定：以Fold Change≥2或Fold Change≤0.5，且P<0.05條件下篩選出差異顯著的脂質代謝物。

1.2.4數據統計分析 采用Microsoft Excel 2019軟件(Microsoft，美國)進行數據統計和可視化作圖，數據結果以平均值±標準誤(Standard error，SE)表示。利用SPSS 18.0軟件(IBM-SPSS，美國)對同一時期大葉山螞蝗不同磷水平處理下的各指標進行獨立樣品T檢驗方差分析。脂質分析采用LipidSearch version 4.1(Thermo Fisher Scientific，USA)進行質譜數據分析篩選出潛在脂質分子，數據導入MetaX進行數據預處理和后續分析。采用SIMCA-P 14.0進行有監督的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1 缺磷脅迫對大葉山螞蝗生長的影響

如圖1所示，缺磷脅迫會抑制大葉山螞蝗生長。從-P處理的10 d開始，地上部的干重顯著降低了29.9%～56.0%(P< 0.01，圖1B)。但是，-P處理5 d和10 d對根系生長有促進作用，表現為根系干重顯著增加33.9%～24.0%(P<0.05)(圖1C)。+P處理相比，-P處理5～15 d，大葉山螞蝗地上部和根系磷含量顯著降低52.38%～87.95%和54.55%～77.78%(P<0.01，圖1D,E)。以上結果表明，缺磷脅迫顯著抑制了大葉山螞蝗地上部的生長，降低了地上部和根系全磷含量，而短期缺磷處理(5 d和10 d)會促進了根系的生長。

圖1 缺磷脅迫對大葉山螞蝗的生長和生理指標的影響Fig.1 Effects of low phosphorus stress on the growth and physiological indictors of Desmodium gangeticum注：(A)缺磷脅迫下大葉山螞蝗在不同時期的生長表型；(B)地上部干重；(C)根系干重；(D)地上部磷含量；(E)根系磷含量。*表示同一時期正常供磷(+P)和缺磷處理(-P)條件下差異顯著，*：P < 0.05，**：P < 0.01；***：P < 0.001。下同Note:(A) Growth phenotypes of D. gangeticum at different periods under low phosphorus stress;(B) Shoot dry weight;(C) Root dry weight;(D) Shoot P content;(E) Root P content. *,** and *** indicate significant difference between +P and -P treatments under the same stages at 0.05,0.01 and 0.001 level,respectively. The same as below

2.2 大葉山螞蝗葉片響應缺磷脅迫的脂質組分析

對-P處理與+P處理的大葉山螞蝗葉片進行脂質組分析。PCA結果顯示，-P處理的3個生物學重復(-P_1，-P_2，-P_3)與+P處理的3個生物學重復(+P_1，+P_2，+P_3)在第一主成分(PC1)明顯分離，分別聚為一類，可以解釋66.7%脂質代謝物的差異變化，表明處理間的差異明顯，可用于后續分析(圖2A)。大葉山螞蝗葉片脂質代謝組共檢測到240個脂質，其中無顯著差異脂質158個，占所檢測到脂質的65.83%；-P處理上調脂質43個，占所檢測到脂質的17.92%；-P處理下調脂質39個，占所有代謝物的16.25%(圖2B)。

圖2 脂質代謝物主成分分析(A)及火山圖(B)Fig.2 Principal component analysis of lipid metabolites (A) and volcanic plot (B)注：(A)橫軸為第一主成分(PC1)，縱軸為第二主成分(PC2)。(B)綠色為下調的顯著差異脂質代謝物，紅色為上調的顯著差異脂質代謝物，不顯著的脂質代謝物為灰色Note:(A)The horizontal axis is the first principal component (PC1) and the vertical axis is the second principal component (PC2). (B) Significantly differentially down-regulated lipid molecules are in green,significantly up-regulated differential lipid molecules are in red,and insignificant lipid molecules are in gray

將82個差異脂質(上調脂質43個，下調脂質39個)進行分類，其可分為甘油磷脂類(GP)、糖脂類(SL)、甘油脂類(GL)、固醇脂類(ST)四大類(圖3)。其中，39個下調的代謝物全為甘油磷脂類，包括磷脂酰乙醇胺(14個)、磷脂酰甘油(8個)和磷脂酰肌醇(6個)等八個亞類；43個上調的代謝物均為不含磷的脂質，包括糖脂類(38個)，甘油脂類(3個)和固醇脂類(2個)。以上結果表明，缺磷脅迫導致大葉山螞蝗葉片中含有磷酸基團的甘油磷脂質的相對含量降低，而不含磷的脂質的相對含量顯著增加。

圖3 差異脂質代謝物分類Fig.3 Classification of differential lipid metabolites注：綠色為下調的差異脂質代謝物，紅色為上調的差異脂質代謝物。縮寫分別表示GP,甘油磷脂類;SL,糖脂類;GL,甘油脂類;ST,固醇脂類;PE,磷脂酰乙醇胺;PG,磷脂酰甘油;PI,磷脂酰肌醇;PA,磷脂酸;PS,磷脂酰絲氨酸;PC,磷脂酰膽堿;LPC,溶血磷脂酰膽堿;PEth,磷脂酰乙醇;DGDG,雙半乳糖基二酰甘油酯;MGDG,單半乳糖二酰基甘油酯;SQDG,硫代異鼠李糖二酰基甘油;MGMG,單半乳糖單酰基甘油酯;DGMG,雙半乳糖基單酰甘油酯;SQMG,硫代異鼠李糖單酰基甘油;StE,豆甾醇酯;SiE,谷甾醇酯;DG,甘油二酯Note:Green represented down-regulated differential lipid metabolites,red indicated up-regulated differential lipid metabolites. Abbreviations represented that GP,glycerophospholipids;SL,saccharolipids;GL,glycerolipids;ST,lipids;PE,phosphatidylethanolamine;PG,phosphatidylglycerol;PI,phosphatidylinositol;PA,phosphatidic acid;PS,phosphatidylserine;PC,phosphatidylcholine;LPC,lyso-phosphatidylcholine;PEth,phosphatidylethanol;DGDG,digalactosyldiacylglycerol;MGDG,monogalactosyldiacylglycerol;SQDG,sulfoquinovosyldiacylglycerol;MGMG,monogalactosylmonoacylglycerol;DGMG,digalactosylmonoacylglycerol;SQMG,sulfoquinovosy-lmonoacylglycerol;StE,stigmasteryl ester;SiE,sitosteryl ester;DG,diglyceride

2.3 缺磷脅迫對大葉山螞蝗葉片甘油磷脂積累的影響

脂質組分析發現，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片中鑒定到39個顯著下調的脂質，均為甘油磷脂類(圖4)。其中，與+P處理相比較，-P處理的大葉山螞蝗葉片中，下調的磷脂酰乙醇胺(PE)有14個(相對含量降低了50.69%～98.31%)，下調的磷脂酰甘油(PG)有8個(相對含量降低了50.25%～86.41%)，下調的磷脂酸(PA)有5個(相對含量降低了53.27%～69.88%)，下調的磷脂酰肌醇(PI)有6個(相對含量降低了50.98%～82.08%)，下調的磷脂酰絲氨酸(PS)有3個(相對含量降低了55.95%～81.95%)，及磷脂酰膽堿PC(32∶0) 相對水平降低了62.11%，溶血磷脂酰膽堿LPC(18∶2) 降低了64.99%，磷脂酰乙醇PEth(34∶1) 降低了79.12%。以上結果顯示，下調數目和相對含量降低最多的是PE，其次是PG。

圖4 顯著下調差異脂質代謝物Fig.4 Significantly down-regulated differential lipid metabolites注：其他類包含了磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)、磷脂酰乙醇(PEth)Note:Others including phosphatidylcholine (PC),lyso-phosphatidylcholine (LPC),phosphatidylethanol (PEth)

2.4 缺磷脅迫對大葉山螞蝗葉片糖脂、固醇脂和甘油脂積累的影響

脂質組分析發現，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片中鑒定到43個顯著上調的脂質代謝物，其均為不含磷的脂質(圖5)。其中，糖脂類(上調38個)尤為顯著，13個雙半乳糖基二酰甘油酯(DGDG)上調幅度最大的為DGDG(40∶1)(34.78倍)；7個硫代異鼠李糖二酰基甘油(SQDG)上調幅度最大的為SQDG(35∶0)(9.38倍)；7個單半乳糖二酰基甘油酯(MGDG)上調最高的為MGDG(42∶1)(17.51倍)；雙半乳糖基單酰甘油酯(DGMG)和單半乳糖單酰基甘油酯(MGMG)均包含4個上調的代謝物，上調最高的分別為DGMG(24∶0)(1332.57倍)和MGMG(23∶4)(18.25倍)；3個硫代異鼠李糖單酰基甘油(SQMG)上調最高的為SQMG(18∶0)(8.40倍)。此外，3個固醇脂類最高上調的是豆甾醇酯StE(18∶3)(3.75倍)，2個甘油脂類最高上調的是甘油二酯DG(35∶2)(2.57倍)。以上結果顯示，在缺磷脅迫下，大葉山螞蝗葉片中大量不含磷的脂質的積累增加。

圖5 顯著上調的差異脂質代謝物Fig.5 Significantly up-regulated differential lipid metabolites

3 討論

低磷脅迫會抑制植物的生長發育[16]。大量研究顯示，缺磷會顯著降低植物磷含量，進而抑制植物地上部的生長，降低其生物量。本研究也發現缺磷脅迫處理大葉山螞蝗的10 d和15 d時，其地上部生長明顯受抑制(圖1A)，地上部和根系磷含量也均顯著降低(P<0.05，圖1D,E)。該結果與其他植物中表現一致，比如柱花草(Stylosanthesguianensis)、水稻、大豆、白羽扇豆(Lupinusalbus)等[17-20]。

在低磷脅迫下，植物通過調整根系形態和構型，促進對外源磷的獲取效率以提高磷吸收效率，包括增強側根的生長、增加根毛密度、擴大根系分布范圍等，這是植物適應低磷環境的有效策略之一[1,21]。本研究也發現，短期(5 d和10 d)的缺磷處理會促進大葉山螞蝗根系生長，但隨著缺磷處理時間延長(10 d)，根系生長也會受到抑制(圖1)。表明當遭受缺磷脅迫時，大葉山螞蝗可能通過分配更多的碳水化合物至根系，促進其快速生長，以期獲取更多的磷營養響應磷饑餓脅迫。

在缺磷環境中，植物加強對體內含磷代謝物的活化再利用以提高磷利用效率，包括核酸、磷脂、磷酸糖和磷酸化蛋白等[22]。磷脂是生物膜的主要組成成分，脂質磷占植物有機磷庫的30%，在低磷環境中，磷元素供應不足，植物會通過降解膜磷脂釋放Pi，再通過大量合成不含磷的脂質替代磷脂，維持生物膜完整性，幫助植物在缺磷環境下生存[1]。磷脂的循環再利用主要包括兩個關鍵代謝過程，即磷脂降解和膜脂重塑。對于磷脂降解，含磷脂質(磷脂)通過磷脂酶水解，可釋放Pi，供植物再利用[23]。前人研究顯示，低磷脅迫下，多個作物根系中的多種磷脂水平顯著降低，包括大豆、木豆(Cajanuscajan)、玉米[19,24-25]。本研究也發現，缺磷脅迫下大葉山螞蝗葉片大量磷脂代謝物相對水平顯著降低，主要包括PE、PG和PA等(圖3,4)。結果暗示，大葉山螞蝗葉片中大量含磷脂質被降解再利用，是其適應缺磷脅迫的重要策略之一。對于膜脂重塑，是植物通過磷脂降解產生的DAG為骨架，大量合成不含磷的脂質(如半乳糖脂質、硫脂、葡萄糖醛酸脂等)替代含磷膜脂，維持生物膜的結構和穩定性[1]。對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、燕麥(Avenasativa)和山龍眼科(Proteaceae)等植物中已被證實，在缺磷環境中，磷脂可以被半乳糖脂、硫脂和葡萄糖醛酸脂等不含磷的脂質取代以釋放出磷酸基團[9,26-28]。本研究中，缺磷脅迫下的大葉山螞蝗葉片中大量不含磷的脂質(38個糖脂、3個類固醇脂和2個甘油脂)相對水平顯著升高(圖3,5)。結果暗示，缺磷環境下，大葉山螞蝗葉片中磷脂被不含磷的脂質替換，在維持細胞膜完整性的同時促進了體內磷的循環再利用。

4 結論

綜上所述，磷的缺乏顯著抑制大葉山螞蝗地上部的生長，降低其全磷含量。大葉山螞蝗可能通過促進根系生長，加強葉片含磷脂質(主要是PE，PG和PA等)的降解和大量累積不含磷的脂質(主要是半乳糖脂和硫脂)，提高體內的磷利用效率，以適應缺磷脅迫。