雙歧桿菌對高脂飲食誘導的C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝的影響

石 英，拉巴普尺，張丹瑛，翁書強*，劉心怡，汪皓琪*

1.奉賢區中醫醫院消化科，上海 201400

2.日喀則市人民醫院消化科，日喀則 857000

3.復旦大學附屬中山醫院消化科，上海 200032

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是慢性肝病的首要病因［1］，在肥胖人群中，NAFLD發病率可高達75%，在全球范圍內NAFLD人群所占比例達15%～30%［2］。隨著肥胖及其相關代謝綜合征全球化的流行趨勢，該病在我國患病率逐年升高。如何預防和治療NAFLD是近年來大量研究者的關注熱點之一［3］。

腸道微生物對人體的健康起到了至關重要的作用［4-6］。不僅基礎狀態下腸道菌群的組成與疾病的發生風險相關，腸道菌群的失衡與消化疾病、心血管疾病、神經系統疾病等的發生密切相關［7-8］。腸道微生態與NAFLD的發生發展關系密切。Buchman等［9］發現，基礎狀態下，變形菌門（尤其是Gamma變形菌亞類）含量較高，與發生脂肪肝的風險較低相關，而基礎狀態下丹毒絲菌綱（硬壁菌門的成員）含量較高與脂肪肝的高風險相關。與單純性脂肪變性患者和健康對照者相比，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者的擬桿菌門數量顯著降低，對體質指數（BMI）進行校正后也如此。同時，與單純性脂肪變性組相比，NASH患者的毛螺旋菌科種數量增加，然而在對BMI和脂肪攝入量進行校正后，這種差異的顯著性喪失［10］。相比對照組，NASH和肥胖患者中觀察到硬壁菌門和擬桿菌門數量降低，但NASH患者和肥胖患者的擬桿菌門和硬壁菌門的豐度相似。NASH組中大腸桿菌的增加可能導致乙醇水平升高，因為這些微生物能夠產生乙醇［11］。Zhang等［12］發現，NASH患者的腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數量明顯低于對照組，而腸桿菌和腸球菌病原菌數量明顯高于對照組。

近年來，基因組學和代謝組學的發展為調節腸道菌群防治NAFLD的思路提供了可行性［13-14］。因此，利用基因、代謝組學的分析方法，從中突破尋求NAFLD防治新方案值得深入。

1 材料與方法

1.1 試驗模型的建立C57BL/6小鼠32只，8 周齡，SPF級，體質量（20±2）g，購自上海SLAC實驗動物有限公司。置于12 h的光照下循環和溫度控制的環境。于復旦大學實驗動物部SPF級飼養。動物飼養溫度（22±2）℃。通過西方高脂飲食建立小鼠NAFLD模型。高脂肪飲食(Research Diet D12492）和對照飲食（對照標準飼料TP26338，南通特洛菲飼料科技有限公司）喂養小鼠24周后處死，取肝臟行病理檢測判斷脂肪肝模型建立是否成功。小鼠進入動物房后適應性喂養1周，然后隨機進行分組：對照飼料組（NC組）、對照飼料加雙歧桿菌干預組（NB組）、高脂飼料組（HF組）、高脂飼料加雙歧桿菌干預組(FB組)，每組分2籠，每籠飼養4只。每只小鼠每天進行雙歧桿菌菌液（含雙歧桿菌 1×109CFU /mL）灌胃 200 μL/d，菌液現用現配，直至實驗結束。

1.2 標本采集每周記錄1次小鼠體質量及進食量，干預周期為24周。采集標本前 1 d晚上開始禁食，自由進水。小鼠稱重后，以5%（0.1 mL/10 g）水合氯醛腹腔注射麻醉。用摘眼球法采血至EP管中，隨后用脫頸椎法處死小鼠。立即取出肝臟稱重，計算肝臟指數（肝臟質量/體質量）并放入凍存管并置入液氮罐內，同時取結腸、糞便凍存。EP管中的血液靜置2 h后分離血清（4 000 r/min離心15 min）用于后續實驗。

1.3 血清學檢測使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測小鼠谷氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉肽酶（GGT）、血清葡萄糖、血清總膽固醇和血清三酰甘油。

1.4 病理學檢測小鼠處死后肝臟、回腸和結腸組織用 10% 甲醛固定。常規脫水、包埋、切片后制成石蠟切片，并用蘇木精-伊紅（H-E）染色。肝臟組織用油紅 O 和 Masson 三色（Sigma-Aldrich公司，美國）染色評估脂肪變性程度。回腸及結腸組織進一步行閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1，ZO-1)、緊密連接蛋白（occludin）免疫組化檢測。切片的每個位點觀察5個高倍鏡視野（×400），分別計數陽性細胞的百分率（0～5%：0分；6～25%：1分；26～50%：2分；50%：3分），染色強度（0～3分），陽性率×著色強度＝免疫組化積分。并予以油紅O染色液染色觀察脂肪變性情況。按照Masson三色法步驟來染色，觀察組織中纖維化情況。

1.5 實時熒光定量PCR通過實時熒光定量PCR方法測定腸道組織中occludin、ZO-1、TNF-α、白細胞介素6（IL-6）的基因表達水平。從小鼠回腸和結腸組織提取總RNA（Takara Bio公司，日本），測定濃度后使用 SYBR Premix Ex Taq(Takara公司，日本）進行逆轉錄，使用ABI PRISM 7,500實時熒光定量PCR進行擴增，采用兩步法PCR反應。反應混合物為在 95 ℃下孵育 300 s，然后進行 35 倍放大，95 ℃ 下 30 s、60 ℃ 下 30 s和72 ℃ 下 30 s的循環。設定同樣的熒光閾值，采用相對定量方法用來確定經過不同處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異，結果用 2?ΔΔCt方法計算。

1.6 Illumina Miseq 測序采用Miseq對腸道菌群進行分析，尋找優勢菌種，并應用實時熒光定量PCR檢測高脂組及對照組糞便腸道菌群數量及優勢菌群的差異。步驟如下，（1）基因組DNA抽提：完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。（2）PCR擴增：PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR儀采用ABI GeneAmp?9700型；全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）切膠回收PCR產物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。（3）熒光定量：參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor?-ST藍色熒光定量系統（Promega公司）進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。（4）Miseq文庫構建：連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。（5）Miseq測序：DNA片段的一端與引物堿基互補，固定在芯片上；另一端隨機與附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋”；PCR擴增，產生DNA簇；DNA擴增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP，每次循環只合成1個堿基；用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第1輪反應所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團”和“終止基團”化學切割，恢復3＇端黏性，繼續聚合第2個核苷酸；統計每輪收集到的熒光信號結果，獲知模板DNA片段的序列。（6）生物信息分析。

1.7 統計學處理采用SPSS19.0軟件進行統計分析，近似正態分布的定量資料采用x±s表示。應用析因設計方差分析進行統計高脂因素及雙歧桿菌因素的作用，多組間樣本均數比較采用ANOVA方差分析進行檢驗，組間兩兩比較，如符合方差齊性，采用Bonferroni方法進行檢驗，如方差不齊，采用Tamhane方法進行檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 雙歧桿菌對小鼠進食量及體質量的影響經24周西方高脂飼料飲食造模，結果（圖1）顯示：高脂飼料組小鼠攝入量明顯比對照飼料組多，但高脂飼料模型組間，雙歧桿菌灌胃組攝入量及能量不變，小鼠體質量顯著減輕。從體質量上可看出雙歧桿菌對西方高脂飲食引起的NAFLD有減輕體質量作用（圖1）。結果（圖1、圖2）顯示，模型組小鼠肝臟質量明顯增加（P＜0.001），經雙歧桿菌灌胃處理后可顯著減輕高脂組肝臟質量。

圖1 生長曲線圖及肝臟質量圖

圖2 肝臟大體圖

2.2 小鼠空腹血糖及血脂情況結果（圖3）顯示：高脂組小鼠血糖及血清總膽固醇升高，經雙歧桿菌干預后，血糖及血清總膽固醇有下降趨勢，血清三酰甘油各組間差異無統計學意義。

圖3 血糖及血脂圖

2.3 檢測小鼠血清轉氨酶結果（圖4）顯示：高脂飲食NAFLD造模組小鼠ALT、AST、GGT、ALP顯著升高（P＜0.001），經雙歧桿菌干預后，AST顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.001），ALT、GGT、ALP雙歧桿菌干預組比高脂飼料組下降趨勢，提示雙歧桿菌可改善NAFLD的肝功能損傷。

圖4 雙歧桿菌干預后轉氨酶變化

2.4 肝臟H-E染色、油紅O染色和Masson染色結果（圖5）顯示：對照飼料組、對照飼料加雙歧桿菌干預組肝細胞未見變性，匯管區未見炎癥。而高脂飼料組肝臟肝細胞出現脂肪變性，肝細胞變性程度為重度，匯管區未見炎癥，而高脂飼料加雙歧桿菌干預組肝細胞也存在脂肪變性，但變性程度為輕至中度，匯管區未見炎癥。高脂組油紅O染色見高脂組內大量脂滴形成，伴空泡變性，經雙歧桿菌干預后，肝臟內脂滴顯著減少。Masson染色結果顯示，高脂飼料NAFLD疾病模型組出現纖維化條索，而經雙歧桿菌干預后高脂組無纖維化。

圖5 肝臟病理及油紅O染色、Masson染色

2.5 腸道功能檢測回結腸病理NC組、NB組黏膜層，黏膜下層和肌層均無明顯炎癥，而FB組黏膜層及黏膜下層均有輕至中度炎癥，肌層未見炎癥，HF組黏膜層中度炎癥（圖6）。ZO-1和occludin的PCR檢測結果（圖7）顯示：結腸和回腸組織內HF組occludin及ZO-1減少，提示NAFLD組結腸和回腸組織均存在腸道黏膜屏障的損害，而FB組中，ZO-1和occludin均有不同程度的升高，提示雙歧桿菌可通過改善腸黏膜屏障來發揮對NAFLD的保護作用。檢測結腸及回腸組織中TNF-α和IL-6表達，結果顯示高脂飼料組腸道炎癥因子顯著升高，而高脂飼料加雙歧桿菌干預組升高不顯著。

圖6 回腸、結腸病理圖

圖7 腸道屏障及炎癥指標

2.6 高通量檢測各組間腸道菌群差異結果（圖8A）顯示：此次檢測深度足夠。高脂組腸道菌群多樣性下降，經雙歧桿菌干預后，可恢復腸道菌群多樣性（圖8B）。圖8C和圖8D顯示各組間腸道菌群存在顯著差異，高脂飼料組與對照飼料組比較，存在腸道菌群失衡，高脂飼料組經雙歧桿菌干預后可改變腸道菌群。結果（圖8E）顯示從門水平，高脂組優勢菌屬為擬桿菌門，而對照飼料組和對照飼料加雙歧桿菌干預組優勢菌屬為厚壁菌門。結果（圖8F）顯示：高脂飼料組顯著升高了如下菌屬：Bacteroides、Helicobacter和Alloprevotella。高脂飼料加雙歧桿菌干預組增加了以下菌屬：Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Odoribacter、Anaerotruncus、Roseburia，而減少了以下屬的水平：Bacteroides。而LEfse分析結果顯示這些差異具有顯著性（圖8）。

圖8 16S腸道菌群分析

2.7 析因方差分析結果（表1）顯示，高脂因素對ALT、AST、GGT、血糖、肝臟質量、結腸ZO-1、結腸IL-6都有顯著性作用，而雙歧桿菌干預可減少高脂飲食的作用。

表1 高脂因素及雙歧桿菌干預因素的析因方差分析結果

3 討 論

隨著生活條件的改善及飲食結構的豐富，NAFLD已經成為慢性肝病的第一大病因，影響了越來越多的患者。腸道微生物因其驚人的數量和高度的多樣化被稱為人類的“第2基因組”，對腸道局部免疫屏障功能的維持至關重要，有研究者［15］嘗試應用各種益生菌調節腸道菌群，恢復正常的腸道微生態，已獲得對肝脂肪變性的治療作用。Wong等［16］提出腸道微生物與肝臟疾病不同的機制或假說，包括微生物群對能源利用的影響以及與肥胖的關系；微生物群對導致機體低度炎癥的腸道通透性的影響；腸道微生物群調節膳食膽堿代謝；腸道微生物群調節膽汁酸代謝；腸道微生物群內源性產生肝臟毒性物質（如乙醇）和其他揮發性有機化合物等［17］。

此外，腸道微生物還可以通過多種途徑對機體免疫功能產生影響［18］。有研究［19］證實，無菌動物的免疫功能較正常下降，具體表現為免疫器官形態的縮小以及免疫細胞數量的減少。令人驚喜的是，當無菌動物腸道的微生物得到恢復以后，其腸道及整個機體的免疫功能都得到相應的增強［20］。雙歧桿菌在促進維生素的合成與吸收、調節機體免疫等領域發揮著重要的作用［21］。以往研究［22］發現，雙歧桿菌可能通過誘導DCs活化，從而糾正Th1/Th2細胞的失衡，另一方面，可以通過刺激DCs分泌TGF-β或IL-10調節CD4＋CD25＋Treg數量，進而影響Treg/Th17細胞的分化。

腸道屏障功能損害包括腸道菌群紊亂、腸細胞緊密連接蛋白的改變、腸道通透性增高、血液中脂多糖（lipopoly-saccharide, LPS）升高等［23］。NAFLD患者腸道黏膜通透性增高，緊密連接完整性損傷，腸道革蘭陰性菌細胞壁的成分LPS進入門脈系統，超過肝臟的清除能力后，可形成內毒素血癥［24］。本研究表明，NAFLD模型小鼠末端回腸上皮細胞ZO-1、occludin RNA顯著減少，提示腸黏膜上皮細胞屏障功能減退。而高脂飼料組應用雙歧桿菌干預后可改善腸道屏障功能。

此外，炎癥也在NAFLD的致病中發揮了重要作用，其中，腸道微生物紊亂是驅動炎癥的主要因素［25］。本研究觀察到雙歧桿菌除了能改善肥胖小鼠的腸道屏障功能，同時能降低血清和腸道組織中TNF-α、IL-6等促炎細胞因子表達水平。

綜上所述，與對照飼料組小鼠相比，高脂飼料組小鼠腸道菌群物種豐度和多樣性減少，存在腸道菌群失調，主成分分析（PcoA）及非度量尺度分析（NMDS）均能觀察各組標本微生物菌群構成的比較，結果顯示疾病模型組與陰性對照組腸道菌群構成分隔較遠，構成上存在顯著差異。菌屬差異分析表現為高脂組擬桿菌門增多，厚壁菌門減少，擬桿菌屬增多。由此推測，雙歧桿菌可通過改善腸道菌群紊亂，發揮延緩NAFLD進展的作用。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。