不同陳化年份、不同產地陳皮藥材的六君子湯指紋圖譜的建立

尚爾雨，申國濤，于 新，孫 爽

(1.黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 150040)

陳皮(CitriReticulataePericarpium)為臨床常用中藥，是蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮，道地藥材為廣東新會的茶枝柑果皮[1]。陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的功效?！侗静菥V目》記載：“陳皮，苦能泄能燥，辛能散，溫能和，其治百病，總取其理氣燥濕之功，同補藥則補，同瀉藥則瀉，同升藥則升，同降藥則降”，因此陳皮是一味非常有代表性的理氣藥[2]。陳皮為六君子湯中發揮主要作用的一味藥。六君子湯出自《醫學正傳》，作為基礎方加味治療脾胃病證，現代臨床常用于慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍等屬脾胃氣虛者[3-5]。實驗研究表明，六君子湯藥理作用廣泛，可通過調整細胞因子間的網絡平衡，改善胃腸道的內分泌功能，減輕胃黏膜的炎癥反應，從而發揮對胃黏膜的保護作用[6-7]。

陳皮的復方配伍能夠起到增效作用。李波[7]等研究發現，陳皮與人參配伍，補而不滯，能夠增強抗疲勞作用。李苑等人[8]研究發現，陳皮與黃芪、黨參、白術、甘草等配伍，組成補中益氣湯，其有效成分橙皮苷含量配伍過程中有顯著變化。陳皮作為理氣藥物，對補氣藥物的增效作用是毋庸置疑的，且其揮發類和黃酮類成分也與胃腸道調節和脂質調節密切相關。但是，在補氣方劑中，陳皮究竟有哪些成分、以什么途徑來增加其他藥物療效，目前還未見報道。采用現代分析方法，對陳皮協同增效的物質基礎與作用機制進行了研究。

中藥是多靶點、多成分、共同發揮療效的復雜體系，單味中藥不能全面反映中藥的質量，而應采用更完整性的技術與方法來進行中藥質量的評價[9-10]。

中藥指紋圖譜技術是一種綜合的、可量化的定性定量手段，具有“整體性”特點，能全面反映中藥的綜合質量，可用于控制和評價中藥材的質量[11-14]。

以《本草綱目》所載陳皮“同補藥則補”理論為出發點，基于代謝組學研究策略，以陳皮拆分組分與理氣補氣作用的相關性為切入點，選取15批不同陳化年份、不同產地的陳皮藥材作為實驗對象，采用HPLC法，建立不同產地陳皮的特征指紋圖譜，并進行相似度分析及聚類分析，為“譜-效”關系研究奠定了基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司生產)；AB265-S托利多十萬分之一電子分析天平(瑞士托利多國際貿易有限公司生產)；SB-5200D SCIENTZ超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司生產)；BUCHI R-210型旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI有限公司生產)；指紋圖譜相似度評價軟件“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012年版)。

1.2 試藥

對照品川陳皮素(批號17050510)、蕓香柚皮苷(批號18030408)、橙皮苷(批號171203)、橙皮素(批號171121)；3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮(批號171108)、維采寧-2(批號170610)、甜橙黃酮(批號180117)、異甜橙黃酮(批號180366)、橘皮素(批號170510)；5-去甲川陳皮素(批號170816)。以上對照品均購自北京世紀奧科生物科技有限公司，對照品質量分數≥98%；甲醇、乙腈，色譜純(美國 Mreda 公司生產)；甲酸，色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司生產)；實驗用水為娃哈哈純凈水。陳皮水煎液及含有不同陳化年份、不同產地陳皮的六君子湯及六君子湯各陰性液均為自制。陳皮、人參、半夏、茯苓、白術、炙甘草均購于哈爾濱市同仁堂大藥房。以上藥材經黑龍江中醫藥大學藥學實訓教研室呂邵娃教授鑒定為正品，標本存放于黑龍江中醫藥大學藥學院實驗室。

15批從廣東省收集到的不同陳化年份、不同產地的陳皮，如表1及圖1所示。

表1 15批陳皮陳化年份及產地Tab.1 15 batches of Citri Reticulatae Pericarpium of different aging years and origins

圖1 15批不同陳化年份、不同產地的陳皮藥材Fig.1 15 batches of Citri Reticulatae Pericarpium medicinal materialsof different aging years and origins

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)溶液。梯度洗脫：0～10 min ，90%(甲酸水)；10～50 min ，90%～78%(甲酸水)；50～60 min ，78%～72%(甲酸水)；60～95 min ，72%-42%(甲酸水)；95～100 min， 42%～90%(甲酸水)。檢測波長300 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備

稱取川陳皮素、蕓香柚皮苷、橙皮苷、橙皮素、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮、維采寧-2、甜橙黃酮、異甜橙黃酮、橘皮素、5-去甲川陳皮素標準品適量，精密稱定，分別置于10 mL容量瓶中，分別加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制得對照品供試液。

2.3 樣品供試液的制備

六君子湯古方為陳皮(一錢)，半夏(一錢五分)，茯苓(一錢)，甘草(一錢)，人參(一錢)，白術(一錢五分)，水煎煮。根據古今單位及比例換算得煎煮工藝，分別準確稱取人參、茯苓、炙甘草、陳皮各3 g，白術、半夏各4.5 g，另加大棗二枚，生姜三片，按照上述方劑標準煎煮共10劑六君子湯。藥材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min。陳皮為廣東省的道地藥材，故又名廣陳皮或新會陳皮。實驗樣品為分別從廣東省收集到的不同陳化年份、不同產地的15批陳皮，分別以相同的方法和條件制備陳皮水煎液、含有不同陳化年份、不同產地陳皮的六君子湯及六君子湯各陰性液。分別量取100 mL藥液，6 000 r/min離心10 min后取50 mL上清液置分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量分次溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇定容，作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

取同一份六君子湯樣品(S1)，精密吸取供試品溶液20 μL, 連續進樣6次，記錄6張六君子湯的HPLC圖譜。結果可知，在6次進樣中，各共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分別表示供試品溶液重復進樣6次，R表示6張圖譜生成的共有模式圖譜。圖2 六君子湯精密度試驗Fig.2 Precision test of Liujunzi Decoction

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分別表示同一批藥材的6份供試品溶液，R表示6張圖譜生成的共有模式圖譜。圖3 六君子湯重復性試驗Fig.3 Repeatability test of Liujunzi Decoction

2.4.2 重復性試驗

取同一批陳皮藥材(S2)，按照供試品溶液的制備方法，重復制備6份六君子湯溶液，連續進樣6次。由結果可知，在6次進樣中，各共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明該測定方法的重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗

取同一份六君子湯溶液(S3)，分別在室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時進樣。由結果可知，在6次進樣中，各共有峰相對保留時間與相對峰面積的RSD值均小于3.0%，表明樣品供試液在24 h內穩定。

注：S1、S2、S3、S4、S5、S6分別表示同一供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時生成的譜圖，R表示6張圖譜生成的共有模式圖譜。圖4 六君子湯穩定性試驗Fig.4 Stability test of Liujunzi Decoction

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 指紋圖譜的建立

取表1所示的不同陳化年份、產地的陳皮藥材，加入到六君子湯陳皮陰性液中，藥材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min，分別制備15批六君子湯，按“2.3.4”項下方法進樣檢測，記錄色譜圖及其特征數據。采用國家藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜相似度計算軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版)進行六君子湯指紋圖譜的建立，如圖5、6。

圖5 15批六君子湯HPLC指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of 15 batches of Liujunzi Decoction

注：R為軟件自動生成的15批六君子湯的對照圖譜圖6 15批六君子湯HPLC指紋圖譜與對照圖譜Fig.6 15 batches of Liujunzi Decoction HPLC fingerprint and comparison map

2.5.2 共有峰的歸屬與指認

經過中藥指紋圖譜相似度計算軟件分析出15批六君子湯樣品中共具有69個共有峰，將各峰依次標記為X1～X69，并分別與各陰性液進行對比，以指認每個共有峰的峰歸屬，結果如圖7所示。其中，X2(T7.842)、X6(T11.047)、X8(T11.716)、X60(T75.692)來自于六君子湯中的白術；X22(T33.968)、X47(T58.266)、X48 (T60.046)來自于六君子湯中的茯苓；X16(T25.285)、X33(T45.707)、X39(T50.309)、X50(T61.585)、X51(T64.615)、X58(T73.637)、X59(T74.107)、X63(T78.309)、X64(T79.092)、X65(T82.802)、X66(T83.671)、X67(T85.663)、X68(T88.117)、X69(T92.439)來自六君子湯中的陳皮；其他共有峰(X1、X3～X5、X7、X9～X15、X17～X21、X23～X32、X34～X38、X40～X46、X49、X52～X57、X61～X62)所對應的化合物可能為復方中某幾味藥配伍所產生的，這是由于該實驗是在陳皮的最佳色譜條件下進行測定的，導致六君子湯中其他藥味所含有的成分在該色譜條件下分離度不佳，指認結果見圖8。

注： S1為六君子湯樣品、S2為人參陰性樣品、S3為甘草陰性樣品、S4為白術陰性樣品、S5為茯苓陰性樣品、S6為半夏陰性樣品、S7為陳皮陰性樣品圖7 六君子湯與各陰性液對比圖Fig.7 Comparison of Liujunzi Decoction and each kind of negative liquid

注：峰16：維采寧-2；峰33：蕓香柚皮苷；峰39：橙皮苷；峰58：橙皮素；峰63：甜橙黃酮；峰64：異甜橙黃酮；峰65：川陳皮素；峰67：3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮；峰68：橘皮素；峰69：5-去甲川陳皮素圖8 15批六君子湯共有模式圖譜中各峰的指認Fig.8 Identification of peaks in the shared pattern map of 15 batches of Liujunzi Decoction

2.5.3 相似度分析

對上述15批六君子湯樣品的指紋圖譜數據進行分析，以對照圖譜為參照，各樣品指紋圖譜與對照圖譜進行比較，計算得到各批次六君子湯樣品的相似度(相關系數法)，相似度評價結果見表2。由表2可知，總體顯示15批六君子湯樣品的相似度在0.753～0.985，說明各批次樣品之間有一定的差異，其中，S1、S10、S11、S12、S13與對照指紋圖譜的相似度較小。產生差異的原因可能為：不同產地之間相對地理位置的微小差異、陳化時間及品種對陳皮的影響。但是僅從相似度分析結果無法準確判斷造成不同廠家、不同陳化年份樣品之間差異的化學成分，因此須采用化學計量學的手段進行分析，尋找造成差異的化學成分，以控制六君子湯的質量。

表2 15批六君子湯指紋圖譜相似度評價數據Tab.2 Data of 15 batches of Liujunzitang fingerprint spectrum similarity evaluation

2.5.4 六君子湯指紋圖譜聚類分析

釆用樣品聚類分析法，使用組間平均連接統計量，以歐氏(歐幾里得)距離作為度量方式，對15批含有不同陳化年份、不同產地陳皮的六君子湯進行聚類分析，結果見圖9。

圖9 15批含有不同陳化年份、產地陳皮的六君子湯指紋圖譜聚類分析結果Fig.9 Cluster analysis results of fingerprints of 15 batches of Liujunzi Decoction containing Citri Reticulatae Pericarpium of different ageing years and origins

由聚類分析所得到的樹狀圖分析可知：可將15批含有不同陳化年份、不同產地陳皮的六君子湯分為3大類，一類為S1～S8和S11、一類為S13和S14，一類為S9～S10、S12和S15。其中，在第一大類中，又可分為S3和S4、S7和S8、S5和S11這3小類。

3 討論

前期文獻研究及實驗表明，陳皮中的黃酮類成分可能是發揮胃腸道作用的主要物質，且由于陳皮中生物堿類成分較少，而揮發油在煎煮過程中其有效成分可能會揮發。綜合考慮，對含有不同陳化年份、不同產地陳皮的六君子湯進行了指紋圖譜及方法學考察，實驗前期考察了不同洗脫比例的洗脫能力，發現洗脫比例為0～10 min 90%(A)、10～50 min 90%～78%(A)、50～60 min 78%～72%(A)、60～95 min 72%～42%(A)、95～100 min 42%～90%(A)時，目標峰更加清晰，峰型好，分離效果佳，無拖尾現象，基線平穩。結果表明，波長為300 nm、柱溫30℃、流速1.0 mL下，色譜峰峰形較好，滿足要求，在此條件下采用國家藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜相似度計算軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版)建立得到15批含有不同陳化年份、不同產地陳皮藥材六君子湯的HPLC指紋圖譜及其對照圖譜，在共有模式圖譜中對其中陳皮黃酮的特征峰進行指認。通過不同批次的六君子湯的指紋圖譜量化數據特征峰的數據可以看出，各成分色譜峰的相對保留時間基本沒有變化，RSD%均小于1.0%，但是相對峰面積變化非常顯著，提示不同陳化年份、不同產地的藥材成分含量存在著差異，因此，推測其發揮胃腸道調節及胃腸道免疫作用亦有所差異。

從聚類分析結果可知，S1～S6是一大類，且其產地都為東甲，表明陳皮來源對質量的影響較大；S9、S10、S12聚為一類，且其陳化年份都較短，表明陳皮陳化年份對質量影響較大；由于S12與S11沒有聚為一類，而它們都為陳化4年的陳皮，不同點是品種稍有差異，S11為大紅皮，S12為微紅皮，可知采摘月份可能對陳皮質量有一定的影響，但具體結果還應與藥效數據相互結合進行綜合分析。

本研究旨在建立不同產地陳皮的特征指紋圖譜，并進行相似度分析及聚類分析，為“要補氣，先理氣”的組方原理與中醫思想的傳承提供科學依據，從新的視角合理闡釋理氣作用與補氣作用相互依存的科學實質，為臨床用藥和新藥研究提供指導。